巨噬细胞、上皮细胞、球体细胞、羊水细胞、血管内皮细胞与原代软

巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：

1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。

6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头，把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。

9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。

10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

上皮细胞培养

1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。

2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。

3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。

4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。

6、反复吹打，制成悬液。

7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。

8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。

球体细胞培养

1、琼脂铺底的培养瓶：30ml无菌培养瓶，每瓶中加5 ml 2%琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用。

2、取生长状态良好已连接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞纵横割划成若干小区后，倒出培养液。

3、加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次，加入新培养液3~5 ml，用吸管把已松动的细胞片吸打下来，分装入1~3个含2%琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，数日后便可生长成细胞球体。

4、换液：培养1~2日后，如需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补充新培养液。

羊水细胞培养

羊水中含有胎儿脱落的上皮细胞，可在体外培养用以分析胎儿染色体核型。目前国内外大都采用腹腔羊膜穿刺术，妊娠12-30周的羊水细胞均可培养成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色体分析，最佳孕周为16周左右。因此时羊水增长快，羊水中细胞较多，细胞培养易于生长，而且不易损伤胎儿。国内多数选择的穿刺时间在妊娠的第16-30周。国外现已较多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠时间大致计算（1ml/w）。资料表明，穿刺病例的妊娠结局、分娩方式、胎儿的出生体重等与未穿刺无明显差异。

1、实验材料

2,5%碘酒、75%酒精、无菌棉签和棉球、镊子、20-22号无菌腰穿针、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培养皿、盖玻片等。

2、培养液配制

F-12 85%

小牛血清 15%

双抗 100u/ml

小瓶贮藏 4-8℃

3、操作过程

A（盖玻片培养法）

（1）采样：选择妊娠13-14周妇女，在无菌条件下抽取羊水5ml，立即注入无菌离心管中；（2）收集：离心分离细胞，1000rpm10分钟，去上清，留0.5ml，轻打混匀；（3）接种：30mm培养皿中放盖玻片1张，每片滴混匀的细胞液1-2滴，置培养箱内培养30-60分钟；（4）培养：取出后从盖玻片外加培养液2ml，静置培养48小时后观察细胞生殖状况并定时换液，5-10天后，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；（5）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小时；（6）低渗：倒掉培养液，加预温37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃温育30分钟，镜下可见胀大的羊水细胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液预固定；（7）固定：倒掉低渗液，加5ml固定液固定30分钟以上，反复3次；（8）干燥：将附有细胞的盖玻片斜放于培养皿中，置80℃烤箱处理2-3小时；（9）胶片：将附有细胞的盖玻片用树脂胶封固于玻片上，正面朝外，小心细胞破坏；