微生物细胞大小测定和微生物显微镜直接计数法

实验目的：

1．了解目镜测微计和镜台测微计的构造。

2．掌握用显微测微计测量微生物细胞大小的方法。

3. 了解血球计数板的构造、原理和使用方法。

4. 掌握应用血球计数板测定青霉菌孢子浓度的方法。

实验材料：

1．菌种

啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）24h液体培养物；青霉菌（Saccharomyces cerevisiae）斜面培养物

2．其它

普通光学显微镜、镜台测微计、接目测微计、盖玻片、载玻片、香柏油、滴管、血球计数板、滴管、擦镜纸。

实验原理：

在一定条件下，各种微生物细胞的大小，是微生物形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于微生物细胞很小，只能在显微镜下测量，一般采用显微测微计来测量。显微测微计有镜台测微计和接目测微计两个部件。

镜台测微计是在中央部分刻有精度等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格，每格长度为10mm，用于校正接目测微计。

接目测微计可直接用于测量细胞的大小。它是一块可放在目镜内的圆形玻片，其中央一般有100等分的小格，每小格代表的长度随目镜、物镜放大倍数的大小而改变。通常必须以镜台测微计来校准，从而计算出在一定的接物镜和接目镜的光学系统中，接目测微计每格的实际代表长度，最后方可利用接目测微计直接测量被测对象的长度和宽度。

显微直接计数法，即利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法，各种单细胞菌体的纯培养悬浮液、菌体较大的酵母菌、霉菌孢子、放线菌和真菌的原生质体等均可采用血球计数板计数。将孢子悬液（或菌悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室内，由于载玻片上的计数室盖上盖玻片后的容积（0.1mm3）是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目换算为单位体积内的微生物数目。

样品中菌（或孢子）数（个/ml）＝每小格的平均数´ ´稀释倍数

在这一公式中，1000代表1ml的容积（即1000mm3），0.00025为每一小格的容积（即0.00025mm3），上面公式可进一步改写为：

样品中菌（或孢子）数（个/ml）＝每小格的平均数´稀释倍数´4´106

实验内容：

1.微生物细胞大小测定

（一）目镜测微计的校正

1．放置目镜测微计

取出接目镜，旋开接目透镜，将接目测微计放在目镜的隔板上（有刻度的一面向下），然后旋上接目镜，最后将此接目镜插入目镜镜筒内。

2．放置镜台测微计

把镜台测微计放在显微镜载物台上（有刻度的一面向上）。

3．校正接目测微计

用低倍物镜观察，对准焦距，通过调焦能看清镜台测微计的刻度；移动镜台测微计和转动接目测微计使两者刻度平行；转动推进器从而使两测微计某段起、止线完全重合，数出两条重合线之间的格数。

用同法分别校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

4．计算接目测微计每格的相对长度

接目测微计每格的长度（mm）＝

（二）测定啤酒酵母细胞的大小

取下镜台测微计，将用压滴法制成的啤酒酵母水浸片放在显微镜载物台上，用高倍镜观察，调至物象清晰后，转动接目测微计，测量酵母菌细胞的长度和宽度分别占有几个格数，再将测得的格数乘以接目测微计每格的相对长度即可求出酵母菌细胞的大小。

要求在同一张片上测定10~20个酵母细胞并求出平均值，这样才能代表酵母细胞的平均大小。

最后取出目镜测微计，将接目测微计和镜台测微计分别用擦镜纸擦拭后放回干燥处保存。

2. 微生物显微镜直接计数法

（一）青霉菌孢子悬液的制备

1．取一支孢子成熟的青霉菌斜面培养物，用无菌移液管吸取5ml无菌水加入菌管中。

2．采用无菌操作技术，用接种环将菌管内斜面上的孢子轻轻刮下，注入到盛有玻璃珠的三角瓶中，同样方法将另15ml无菌水分三次再加入菌管中，将剩余的孢子全部刮干净，将孢子液全部合并于三角瓶中，水平旋转振荡30min，然后倒入含有脱脂棉的无菌漏斗中过滤，得单孢子悬浮液。

（二）显微镜下孢子浓度测定

1．稀释

定量取出孢子悬液，加到无菌干燥的试管中，按照一定倍数将其稀释，稀释的程度一般以血球计数板每小格内含有5~10个菌或孢子最为合适。

2．加样

取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管从盖玻片的边缘滴一滴孢子稀释液，则孢子稀释液自行渗入，注意不要产生气泡。

3．计数

静止5min，使孢子沉降不再流动，然后即可在显微镜下观察计数。先在低倍镜下找到计数室的位置，然后换成高倍镜计数。如发现孢子悬液太浓或太稀释，应重新稀释并计数。计数一个样品要从两个计数室中的计算结果取平均值，以减少实验误差。

4．清洗血球计数板

计数完毕，将血球计数板取下，在水龙头上用水柱冲洗，切忌用硬物洗刷，然后自然吹干，镜检观察是否有孢子或其他沉积物，直至洗刷干净。