细胞化学技术（cytochemistry）-1

细胞化学技术（cytochemistry）是在保持细胞结构完整的条件下，通过细胞化学反应研究细胞内各种成分(主要是生物大分子)的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化的技术，可以通俗地说，这类技术让人们在显微镜下看到细胞内大分子的位置。这类技术包括光镜和电镜水平的酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术和原位杂交技术等。

一、 酶细胞化学技术

酶细胞化学技术（enzyme cytochemistry）是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。早期的酶细胞化学工作是在光学显微镜下进行的，称为组织化学（histochemistry），随着电镜技术的发展开始用电镜观察酶的分布，称为电镜酶细胞化学技术（electron microscopic enzyme cytochemistry）。酶细胞化学技术对研究细胞器的结构与功能、细胞的生理与病理过程以及细胞器的相互关系曾发挥重要作用。近来酶细胞化学技术的单独运用大为减少，但是这一技术的原理导致免疫组织化学或细胞化学技术的诞生和不断更新，而后者则是研究细胞中大分子定性和定位最简便有效的手段，正得到极为广泛的应用。因此有必要了解酶细胞化学技术。

（一）酶细胞化学技术的原理

显微镜下无法直接观察到细胞内的酶，通过酶细胞化学反应才能间接地反应酶的存在位置。酶细胞化学的原理是：在一定条件下，使组织细胞内的酶与其底物相互作用，形成初级反应产物，再用捕捉剂在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下可见。这一反应过程所示如下：

┌──── 酶细胞化学反应 ──────┐

初级捕捉剂最终

酶＋底物────> 反应产物 ─────> 反应产物

└─ 酶反应 ─┘└── 捕捉反应 ───┘

从上式可见，酶细胞化学反应实际上由两项反应组成。前面的酶反应相当于细胞内自然条件下发生的酶促反应，后面的捕捉反应则是为了使酶反应可见而人为造成的。

捕捉反应的目的是使酶反应产物形成在显微镜下可见的最终反应产物，即最终反应产物在光镜下具有鲜明颜色，在电镜下具有高电子密度。捕捉反应主要有金属盐沉淀法、色素形成和嗜锇物质生成法。如：金属盐沉淀法将重金属作为捕捉剂，使酶反应产物直接或间接与之结合生成金属盐沉淀。在色素形成和嗜锇物质生成法中，捕捉底物在酶作用下转化成色素沉淀于酶作用部位，在光镜下可见；或者捕捉底物转化成嗜锇物质，经锇酸作用后形成高电子密度的锇黑，在电镜下可见。

在生物化学中，酶被分成水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂合酶、合成酶和异构酶六大类。现以水解酶为例介绍如下：

初级反应： 底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸

最终反应： 磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物磷酸铅（黑色、高电子密度）

 

 

（二）实验方法

1、样品制备

酶细胞化学的一个重要问题是既要保存好细胞内酶的活性，又要保存好细胞的结构，因此选择适当的固定剂种类、浓度、固定的方式和时间是细胞化学技术的一个关键问题。光镜样品固定多选用中性福尔马林或多聚甲醛,4℃、24小时，常规的石蜡包埋切片可以满足相当一部分酶的细胞化学要求；电镜样品固定通常用0.5～2％戊二醛或4％多聚甲醛,4℃、2小时，再切成5～100μm的厚片用于细胞化学反应，反应后经常规的锇酸后固定，脱水、包埋、超薄切片、至电镜下观察。冷冻切片能较大限度地保存酶的活性，因此是光、电镜酶细胞化学技术中常用的方法。

2、酶细胞化学反应

酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂，保证孵育液pH 的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片，至电镜下观察。

3、基本实验过程

光镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→ 冷冻切片 → 细胞化学反应

（酶反应＋捕捉反应）→ 光镜观察

电镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→切组织片→细胞化学反应

（酶反应＋捕捉反应）→脱水包埋→ 超薄切片→电镜观察
二、 免疫细胞化学技术

免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗原抗体特异结合的特性定位组织和细胞中特异大分子的一类技术。它包括光镜水平（简称免疫组化）和电镜水平(简称免疫电镜)的免疫细胞化学技术。应用免疫细胞化学技术可在原位检测细胞的各种大分子，如蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等。

（一）免疫细胞化学技术的原理

免疫细胞化学技术的原理是：把组织中的特异分子作为抗原，用各种在显微镜下

可见的标记物标记特异抗体或标记抗原抗体复合物，使特异的免疫化学反应具有可见性，从而间接地显示抗原，达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。

1． 抗原

用免疫细胞化学技术检测的分子可以是各种大分子，它们在这一技术中扮演抗原的角色。所以，细胞中的任何分子，只要其结构复杂到一定程度，具有免疫原性，能作为抗原或半抗原，从而能导致针对它的抗体产生，都能作为靶分子，用该技术得到检测。它们可以是蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等，最常见的待检分子是蛋白质、多肽。除了检测组织和细胞中天然存在的蛋白质、多肽，该技术还能检测在培养细胞中人为表达的重组蛋白质分子。方法是利用分子生物学技术制备重组DNA时导入一段序列，该序列编码一个多肽与重组蛋白质连接在一起，该多肽作为抗原或半抗原能导致针对它的抗体产生。当这一重组DNA在培养细胞中表达时，可以因为含有特异抗原或半抗原多肽，而能用免疫细胞化学技术检测到，因而重组蛋白质也就能在同处被检测到。免疫细胞化学技术的这种巧妙应用，近来在研究新克隆得到的蛋白质分子的定位中发挥很大作用，也为该技术开拓了更广阔的应用空间。

2． 抗体

单克隆和多克隆抗体，可从市售获得或自行制备。在免疫细胞化学技术中可以有

两个层次的抗体。针对抗原的抗体称为第一抗体，针对第一抗体的抗体称为第二抗体。

3．免疫细胞化学中的标记物

免疫细胞化学技术是用已知的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法，但抗原抗体相结合的复合物在显微镜下是看不见的，必须用特殊的标记物对抗体或抗原抗体复合物进行标记，才能使抗原抗体复合物在显微镜下具有可见性。常用的标记物有以下几种：

⑴荧光素用荧光素标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合，

在荧光显微镜下检测荧光素所发荧光，便可知抗原的分布部位，常用的荧光素有绿色荧光的异硫氰酸荧光素和红色荧光的罗达明B200等。

⑵酶用酶标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合，利用酶细胞

化学方法显示该标记酶以达到显示抗原的目的。常用的标记酶如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）与其底物H2O2和氨基联苯胺相遇时，形成的棕色沉淀可在光镜下观察到，遇锇酸反应后形成锇黑电镜下呈高电子密度。

⑶胶体金将胶体金与抗体结合形成金标记抗体，再与相应的抗原结合，形

成显微镜下可见的电子致密的金颗粒。常用的胶体金颗粒直径为5～60nm。

⑷亲和物质亲和物质是一种有多价能力的物质，不仅与另一种亲和物质有

高度的亲和力，而且可与抗体蛋白及各种标记物如荧光素、酶、胶体金等结合，因而可以通过荧光显微镜、酶加底物显色反应等定位某种特异分子。常用的亲和物质系统有生物素－亲和素系统、葡萄球菌A蛋白－免疫球蛋白系统。

⑸铁蛋白将铁蛋白通过一种低分子的双功能试剂与抗体相结合，它既保

留了抗体的免疫活性又具有显微镜下可见的高电子密度核心。

2、免疫细胞化学中的直接法和间接法

直接法：用标记的特异抗体直接检测相应抗原的方法称为直接法。

间接法：用未标记的特异抗体（第一抗体）与组织中的抗原结合，再用标记的第二抗体与第一抗体结合，间接检测组织中的抗原。这种方法因为在第一抗体上可以结合多个标记的第二抗体，所以其灵敏度比直接法更高

（二）实验方法

免疫细胞化学技术的实验方法包括标记抗体的准备、组织样品的制备及免疫细胞化学反应。

1、标记抗体准备 抗体标记的基本方法是利用分子间电荷等作用力或使用交联剂，将抗体与标记物连接在一起。但在绝大多数情况下，标记抗体从市场购得。

2、样品制备 样品固定时既要保存好组织细胞结构和抗原位置又要保存好抗原

性。常用的光镜固定剂为多聚甲醛，冷冻切片或常规石蜡包埋、切片；电镜样品多选用多聚甲醛与低浓度戊二醛（0.05～0.5%）混合液，锇酸损伤抗原性，不能在细胞化学反应前使用。电镜免疫细胞化学反应可在未经包埋的组织片上进行，称包埋前技术；也可在超薄切片上进行，称包埋后技术。此外，冷冻超薄切片可直接用于电镜免疫细胞化学反应。

3、基本实验过程

光镜样品

固定（抗原固定＋结构固定）→ 冷冻切片或石蜡包埋切片→

免疫细胞化学反应→ 光镜观察

电镜样品（包埋前技术）

固定（抗原固定＋结构固定）→切组织片→免疫细胞化学反应→脱水包埋

→超薄切片→电镜观察

电镜样品（包埋后技术）

固定（抗原固定＋结构固定）→脱水包埋→超薄切片

→免疫细胞化学反应→电镜观察