细胞组分的化学反应

一、实验目的

了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。

二、实验用品

1.材料和标本蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。

2. 器材和仪器光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。

3.试剂PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)

三、实验内容

细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。

1.细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示

（1）原理

由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。

（2）方法

① 以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。

② 将涂片作好标记放在70％乙醇中固定5分钟，室温晾干。

③ 放入5％三氯醋酸中60℃30分钟，抽提出核酸。

④ 清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。

⑤ 滤纸吸干玻片上水分。

⑥ 一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色10～15分钟,另一张片放入0.1％酸性固绿(pH2.0～2.5)染色5～10分钟。

⑦清水冲洗，盖上盖片镜检。

3.结果

经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处（参照照片）。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。

2、细胞内过氧化物酶的显示

(1)原理

过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。

(2)方法

① 取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。

② 推片，室温晾干。

③ 将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒~1分钟。

④ 取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。

⑤ 清水冲洗，放入1％番红溶液中复染2分钟。

⑥ 清水冲洗，室温晾干。

⑦ 镜检或封片后镜检。

（3）结果

涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。

3、过碘酸雪夫反应(PAS)——显示细胞内糖原(参照照片和示教片)

(1)原理

组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法来显示，其化学基础是利用过碘酸的氧化作用，打开碳链形成醛，生成的醛基与Schiff试剂中的无色品红反应形成紫红色化合物。

(2)方法

① 取l~2mm厚的肝组织块，用Carnoy氏液4℃固定4～6小时。

② 乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片。

③ 用70％乙醇展片。

④ 脱蜡：二甲苯(1)5分钟→二甲苯(2)5分钟→100％乙醇5分钟→含1％火棉胶的乙醇液1分钟→70％乙醇1分钟。

⑤ 直接浸入过碘酸酒精液反应5～15分钟，经70％乙醇洗片刻。

⑥ 浸入Schiff氏酒精液反应15分钟。

⑦ 亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料。

⑧ 流水冲洗3～5分钟。

⑨ 蒸馏水洗。

⑩ 浸入Ehrlich苏木精复染20~30秒，使细胞核着色。

⑩ 脱水：95％乙醇3分钟二次→100％乙醇3分钟二次→二甲苯透明10分钟二次。

⑩ 加盖片镜检或树胶封固后镜检。

(3)结果
细胞中呈紫红的颗粒即为糖原