植物酯酶同工酶基因的染色体定位

一、原理

酶和蛋白质是基因表达的产物，基因位于染色体上。当某一对同源染色体缺失时，位于这对染色体上的基因和它们所编码的酶或蛋白质也就随之丢失。以正常小麦及其缺体系为材料，通过蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳和同工酶分析，即可确定编码这些酶或蛋白质的基因在基因组中的定位（位于哪对染色体上）。

酯酶是催化酯类化合物水解的酶系，在细胞代谢过程中起重要作用。电泳分离后，凝胶中的酶催化底物a-或b－乙酸奈酯水解，水解产物与坚牢兰RR盐作用形成褐色或红色的复合物，借此可以鉴定酯酶同工酶的存在、数量和酶活性的大小。

二、目的

通过本实验，可以进一步了解染色体与基因、基因与酶蛋白的关系，加深对于酶是基因表达产物的认识。同时掌握利用缺体品系进行酯酶同工酶基因定位的方法。

三、材料、试剂

1、正常小麦及其缺体系萌发种子或幼苗。

2、Acr-Bis贮备液：30％Acr-0.8%Bis水溶液。

3、Tris-柠檬酸缓冲液(pH 6.8)：1.55g Tris, 0.1g柠檬酸，100ml。

4、Tris-柠檬酸缓冲液 (pH 8.9)：15.5g Tris, 1g柠檬酸，1000ml。

5、1.247%EDTA溶液。

6、15过硫酸胺。

7、TEMED。

8、样品提取缓冲液：0.1M Tris-HCl, pH 7.5, 5% (W/V)蔗糖，0.1M 巯基乙醇。

9、10×电极缓冲液：6.2g Tris, 2g Gly, pH 8.7, 1000ml。

10、a-乙酸奈酯储备液：20mg/ml，溶于丙酮中。

11、坚牢兰RR盐储备液：20mg/ml，溶于丙酮中。

12、磷酸缓冲液：0.1M, pH6.4。

13、1％琼脂糖。

14、加样缓冲液：30％甘油，0.05%溴酚兰。

四、操作步骤

（一）凝胶模具的装配

1、将装配凝胶模具所用的玻璃板、橡胶框、样品梳等用具洗净，晾干。

2、将两块玻璃板固定于橡胶框上，用滴管吸取融化的琼脂糖封住底边。

3、琼脂糖凝固后，将玻璃板及橡胶框一边装在电泳槽上。

（二）凝胶的配制

1、取一个干净烧杯，按表中分离胶的组成依次加入相应的组分，混合。

2、将凝胶板模具稍倾斜，把分离胶溶液沿两块玻璃板上方缓慢倒入，注意防止产生气泡。当液面距顶端3cm时停止灌胶。

3、将胶模垂直放置，在胶液表面用注射器小心覆盖一层蒸馏水（约3mm），室温下聚合。水和胶液两相间出现界面时，表面聚合已经完成。

4、再取一个干净烧杯，按表中浓缩胶的组成配制浓缩胶，混合。

5、用注射器和滤纸吸去分离胶表面的水分，将浓缩胶缓缓倒在分离胶上部，当液面距玻璃板顶部3mm时，立即插入样品梳，室温下聚合。

表18－1　分离胶和浓缩胶的配方

 

 

	分离胶浓度		浓缩胶浓度
	7％	10％	3％	4％
30%Acr-0.8%Bis(ml)	4.5	6.5	1.0	1.3
Tris-柠檬酸pH8.9(ml)	14.2	12.2	…	…
Tris-柠檬酸pH6.8(ml)	…	…	1.0	1.3
1.247% EDTA(ml)	0.8	0.8	0.1	0.2
1%AP(ml)	0.5	0.5	0.3	0.3
TEMED(ul)	20	20	15	15
ddH2O(ml)	…	…	7.6	6.9
总体积(ml)	20	20	10	10

 

（三）样品提取

1、将待测材料用蒸馏水冲洗后，用滤纸吸干。称取所需样量(0.2-0.5g)。

2、剪碎，置于冲浴研钵中，加入2倍体积的样品提取液，匀浆。

3、将匀浆转入1.5ml微量离心管，10000rpm离心10分钟。

4、收集上清液，置4℃冰箱中保存备用。

（四）电泳

1、浓缩胶聚合后，拔出样品梳，加入电极缓冲液，接好电源。

2、吸取30－50ul样品液，加入1／3的30％甘油溶液，混匀。

3、用微量加样器吸取50－80ul混合好的样品，缓慢加入到加样孔中。

4、接通电源，上槽接负极。在20V/cm稳压条件下电泳3小时左右。指示剂距前沿1cm时停止电泳。

（五）染色

1、取下凝胶，切去浓缩胶，用水冲洗后，置培养皿中。

2、将200ml 0.1M磷酸缓冲液(pH 6.0), 10ml a-乙酸奈酯和10ml坚牢兰RR盐混合，倒入培养皿中。

3、37℃恒温箱内保温染色，待褐色的酶带显示清楚后，用蒸馏水冲洗并保存。

4、在X射线观察灯上观察照相，或用薄层扫描仪扫描进行定性定量分析