DNA单链断裂检测技术：单细胞凝胶电泳（SCGE）检测原理和操作步

单细胞凝胶电泳（SCGE）是在核算沉淀法和晕圈分析及弱碱性条件下的单细胞凝胶电泳等检测技术的基础上逐渐发展起来的一种在单细胞水平检测哺乳动物有核细胞DNA断裂的新技术。主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂中性微凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性微凝胶电泳技术，该技术目前主要应用于遗传毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。

1、SCGE检测原理：
一般认为，在通常情况下，DNA双链以组蛋白为核心盘旋形成核小体，在核小体中DNA位负超螺旋结构，如果有去污剂进入细胞，核蛋白被浓盐提取，DNA便形成残留的类核，如果；类核中DNA断裂，就会在核外形成一个DNA晕轮，DNA断裂将引起超螺旋松散，电泳时DNA片段向阳性伸展，形成特征性彗星尾，这时彗星尾可能还与头部有秩序的结构以单链相连。
在中性电泳液中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片方进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。而在碱性电泳液中，DNA双链解螺旋变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断裂或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。细胞DNA受损愈重，产生断裂或键易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强，因此，通过测定DNA迁移部分的吸光度或迁移长度可定量的测定单个细胞DNA损伤的程度。

2、SCGE操作步骤：
（1）制备但细胞悬液：
全血。将5ul全血与75ul低熔点琼脂样相混合。
其他。与75ulLMA混合的细胞悬液的量应小于10ul，通常为5ul左右，保证每载玻片最适细胞数约为10000个左右。
（2）制片：
分别去125 0.5%LMA和0.5%正常熔点琼脂样（NMA）溶于25ml PBS，可稍加热使其充分融解，制备成0.5% LMA和0.5%NMA，进行铺胶。
第一层胶。取110ul保存在45℃的0.5%NMA浇注到全磨砂的Dakin载玻片闪gxunsu盖上1号盖玻片，当心有小气泡产生，置室温1-2min，使琼脂糖凝固。此层主要作用是保证第二层和第三层平整及附着紧密。NMA的量不必太精确，但要铺得平整和均一。
第二层胶。将约10000个悬于5-10ulPBS中的处理组或对照组与75ul 0.5%LMA相混合。轻轻的将盖玻片移开，迅速将细胞混悬液加到第一层琼脂糖上，盖上新盖玻片让其均匀铺开；将载玻片置冰盒上的玻片托盘中3-5min使琼脂糖固化。
第三层。轻轻移开盖玻片，将75ul 0.5%LMA作为第三层加上，放回玻片托盘中待琼脂糖凝固。
（3）裂解：
移开盖玻片，将载玻片缓慢浸入新配制的冰凉的细胞裂解液中，置于4℃冷藏至少1h。细胞可在裂解液中至少保存4周，但时间太长可能会引起缓冲液沉淀。
碱性细胞裂解液配制（每1000ml）方法：
a、2.5mol/L NaCl 146.1g；
b、100mmol/L EDTA 37.2g；
c、10mmol/L Tris 1.2g；
d、用约12g NaOH 调至pH值为10；
e、1%肌氨酸钠10g；
f、用去离子水定容至890ml，过滤除菌，为储备液，室温保存；
g、加新配1%Triton X-100和10%DMSO为应用液，在应用前冷藏30-60min。
中性细胞裂解液配制方法：
a、2mol/L NaCl 117g；
b、30mmol/L EDTA 12.4g；
c、10mmol/L Tris 1.2g；
d、用约12g HCl 调至pH值为8.2-8.5；
e、1%肌氨酸钠10g；
f、用去离子水定容至890ml，过滤除菌，为储备液，室温保存；
g、加新配1%Triton X-100和10%DMSO为应用液，在应用前冷藏30-60min。
（4）电泳：
将冷藏1h后的载玻片从细胞消化液中轻轻取出，并列置于水平凝胶电泳槽中阳极端附近，载玻片间不留空隙。
向电泳槽中加入新配制的电泳缓冲液应用液，使液面完全覆盖载玻片。应防止在琼脂糖上产生气泡。
将载玻片在碱性缓冲液中放置20-60min，让DNA在电泳前解螺旋和产生碱性易损性损伤。时间越长，损伤表现得越充分。
在室温下，置电压25V，调整电泳槽中缓冲液液面高度使电流为300mA，根据研究目的会对照样品的迁移情况，电泳10-40min。不同类型的细胞电泳时间不同。
碱性电泳液应用液（1000ml）：
a、300mmol/L NaOH 12g；
b、1mmol、L EDTA 372.24g
c、称取上述试剂后，用1000ml去离子水融解（pH>13）备用，注意在临用前现配。
中性电泳缓冲液应用液（0.5%TBE）：
a、2mmol/L EDTA；
b、90mmol/L Tris；
c、90mmol/L 硼酸；
d、调pH 8.2-8.5，注意在临用前现配。
（5）中和：
切断电源，将载玻片置染缸，用中和缓冲液浸洗，每次5min。晾干，重复2次。目的是防止碱液和去污剂干扰溴化乙锭染色。
中和缓冲液（0.4mol/L Tris）:
a、Tris 48.5g；
b、加去离子水定容至1000ml；
c、用>10mol/L HCl调pH值至7.5，室温储存。
（6）溴化乙锭染色：
呈中性后，晾干载玻片，将玻片用0.5ulEB应用液染色，盖上新盖玻片。
溴化乙锭（EB）染液（10 x储备液，即20ug/ml）；
a、溴化乙锭 1mg；
b、去离子水 50ml；
c、室温贮存，临用时见储备液稀释10倍。
EB为诱变剂，小心操作。
注意：以上（1）-（3）步应在黄色、红色灯光下或暗处进行，以免额外DNA损伤，载玻片可在潮湿环境中保存72h，但最好在24h内读片。
（7）镜检姐结果评价：
EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下观察。未受损细胞表现为一圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。而受损细胞则有彗星尾从核中伸向阳极，形成一个亮的荧光头部和尾部。用目镜测微尺测定或拍摄X 400黑白显微照片再作测定。每隔样品中至少随机挑选25个细胞测定。测定受试组合对照组核DNA直径和DNA迁移长度，再用透明尺测量彗星迁移部分的面积。也可测其斜度和峭度，因不受试物引起的彗星形状可有差异。
统计时，比较受试组和对照组之间的彗星尾长，或计算受试组（T）与对照组（C）彗星尾长之差（T-C）即T-C<10um（一）；10-20um（±）；20-40um（±）；>40um(++).另外，也可计算各族受损细胞率，即彗星尾长<35um为未损伤；35-70um为中度损伤；>70um为重度损伤，此值在不同细胞稍有差异。