L929细胞增殖MTT比色法检测IL-1的生物活性实验原理和操作步骤

【基本原理】

IL-1具有刺激多种来源的成纤维细胞增殖的作用，可用于IL-1生物活性检测。目前国内外大多数实验室常用L929细胞株（小鼠成纤维细胞瘤细胞）作为检测IL-1生物活性的靶细胞或反应细胞。MTT比色法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-（4.5-dimethylthiazol-2- yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷，形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。故通过反应细胞形成的MTT-甲肷量，即可测定IL-1对L929细胞促增殖作用程度，从而间接测定IL-1的生物活性。

【材料和试剂】

（1）已诱生的IL-1待检样品：倍比稀释成不同浓度。

（2）IL-1标准品：倍比稀释成不同浓度。

（3）L929细胞：作为反应细胞或靶细胞，存活率应>95%。

（4）0.25%胰蛋白酶

（5）10%FCS-RPMI-1640完全培养液

（6）MTT：用PBS稀释成5mg/ml，用0.22μm膜过滤除菌及杂质，4℃避光保存。

（7）酸化异丙醇（含0.04mol/L HCl的异丙醇）：100ml异丙醇中加入0.4ml的36% HCl即可。

（8）96孔细胞培养板，刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，5%CO2培养箱，超净工作台，酶标测定仪，570nm与630nm滤光片。

【操作步骤】

（1）将生长状况良好的L929细胞用0.25%胰蛋白酶消化2-3min；

（2）将L929细胞用10%FCS-RPMI-1640培养液洗涤2次，以去除消化液及原生长培养液；

（3）用10% FCS-RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml；

（4）将L929细胞悬液加至96孔细胞培养板，100μl/孔；

（5）分别加入不同倍比稀释度的IL-1标准品和待测样品于96孔细胞培养板中，100μl/孔，各设3个复孔，同时设立培养液空白对照；

（6）置37℃，5% CO2培养箱中培养56h；

（7）将96孔培养板取出，各孔加入MTT，10μl/孔；

（8）置37℃，5% CO2培养箱中继续培养4h；

（9）取出培养板，先从各孔中轻轻吸出100μl上清液弃去，再加入酸化异丙醇或DMSO，100μl/孔，置室温10~20min，吹打震荡，充分混匀，使 MTT-甲肷产物充分溶解；

（10）用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm，分别测定各孔OD值。测定应在酸化异丙醇加入后lh内完成。

【结果分析】

（1）每孔OD值应为OD570nm-OD630nm，再减去培养液对照OD值，最终每孔OD值应取3复孔的平均值；
（2）以log2[稀释度]为X（横座标），各稀释度对应的OD值为Y（纵座标），在普通坐标纸上，分别绘制出IL-1标准品与待测样品两条回归曲线（如图）。

 

IL-1标准品与待测样品两条回归曲线

（3）经标准品最大OD值一半处（即标准品50%最大OD值处）的A点画一条平行于X轴的横线，由此产生相关于待测样品回归曲线的B点；

（4）A点与B点所对应的横轴上的值为X，因X=log2[稀释度]，则A点与B点对应的稀释度值为：稀释度=2X，求得稀释度。

待测样品IL-1活性单位计算公式：

待测样品IL-1活性
（U/ml）

=

B点对应的样品稀释度

×

标准品IL-1活性（U/ml）

A点对应的标准品稀释度

或者采用下列公式计算:

待测样品IL-1活性
（U/ml）
=

达标准品50%最大OD值对应的样品稀释度

×

标准品IL-1活性
（U/ml）
达标准品50%最大OD值对应的标准品稀释度
【注意事项】

（1）L929细胞存活率应>95%，L929细胞在培养条件不良时，可呈圆形漂浮状，此时更换培养液可使其恢复为正常的梭形贴壁细胞。

（2）应充分洗涤后加入培养板中，且应均匀分散于各孔中，否则可能造成某个部位细胞过密而某个部位细胞过稀，影响细胞单层形成。

（3）标准品及待测样品应从1:2开始至少6个倍比稀释度。

（4）加样时，应从低浓度到高浓度顺序加入，不可共用加样器头。

（5）加入酸化异丙醇后，应在lh内进行OD值测定。

（6）还可按正态概率纸法或概率单位法计算IL-1的活性单位。