淋巴细胞转化实验（Lymphocyte transformation test-LTT）(2)

同位素掺入法淋转试验,较之形态学方法更为客观、准确,重复性也好,但需一定设备条件。

[实验材料]

1.1640 培养液

2.ConA ：根据ConA 的纯度配制成最适浓度，一般为5-10μg/ml 。

3.脂溶形闪烁液：

POPOP（1,4 双（5-苯基恶唑基-2）苯0.4g

PPO[2, 5二苯基恶唑]4g

无水乙醇 200ml

二甲苯 800ml

POPOP 先用少量二甲苯置 37 ℃ 水浴溶解后，再补足其他成分即可。

4.3H-TdR（市售商品）：临用前用培养液稀释成10μCi/ml 。

5.多头细胞收集仪、玻璃纤维滤纸、样品杯,液体亲烁计数器等。

[实验方法]

1.无菌分离淋巴细胞（同E花环）,用1640培养液调制成1X106/毫升,加入96孔培养板,每孔100μl。

2.每孔加 ConA 100μl,每个样品加3孔,另3孔不加ConA作对照。37℃培养约56小时。

3．结束培养前加入3H-TdR0.5-1.0μCi/孔。

4.继续培养6-12小时后,用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上。

5.烤干后,将滤纸放入闪烁杯中,每杯加闪烁液5毫升,液闪仪测定各管cpm 。

[实验结果]

将ConA刺激组和对照组各自的平均cpm值,代入下列公式计算ConA刺激指数（index of stimulation, SI）

SI=ConA 刺激管的cpm均值/对照管的cpm均值

三 淋转试验 MTT 法

[实验原理]

MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）是Mosmann1983年报告的。原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲肷,后者溶于有机溶剂（如二甲基亚枫、酸化异丙醇等）,甲肷产量与细胞活性成正比。可在560nm处用酶标仪测定其OD值。

[实验材料]

1.MTT:PBS配制成5毫克/毫升的储存液,过滤除菌后冻存。

2.溶剂:DMSO、10%SDS、0.04的盐酸-异丙醇。

3.酶标仪

[实验方法]

1.无菌分离淋巴细胞（同E花环）,用1640培养液调制成1X106/毫升,加入96孔培养板,每孔100μl。

2.每孔加ConA100μl,每个样品加3孔,另3孔不加ConA作对照。 37℃培养约56小时。

3.结束培养前加入20μl/孔。继续培养6小时左右。

4.2000转/分钟离心10分钟,弃上清。

5.每孔加 100μl溶剂,轻微震荡使甲肷产物溶解。

6.在酶标仪上波长560nm测定OD值。

[实验结果]

SI=ConA刺激管OD均值/对照管OD均值。

[注意事项]

1.淋巴细胞要新鲜制备,否则会影响实验结果。

2.ConA 刺激时间要根据淋巴细胞转化情况决定，一般为55-66小时。