植物凋亡细胞的形态学观察

一、实验目的
1、掌握细胞凋亡的概念、生物学意义。
2、掌握细胞凋亡与细胞坏死的区别。
3、掌握诱导和观察细胞凋亡的方法。

二、实验原理
（一）概念
凋亡(apoptosis)一词来自希腊语，apo指分离，ptosis指落下。凋亡的原意是枯萎的树叶或花瓣自然凋落。1972年澳大利亚昆士兰大学的kerr等人在许多组织中发现了一种散在的自发的细胞死亡现象，认为这是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡，并首次提出了细胞凋亡的新概念。
多细胞生物在发生、发展过程中，为了保持正常的生理机能，一部分的细胞发生自发性细胞死亡，这种细胞死亡是被细胞内一系列相关的分子所调控，并伴随有典型的形态学改变，这种现象被称为细胞凋亡。
细胞坏死是细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素的伤害，引起细胞死亡的现象。
细胞凋亡和细胞坏死的区别

区别	细胞凋亡	细胞坏死
起因	生理或病理性	病理性变化或剧烈损伤
范围	少数散在细胞	大片组织或成群细胞
细胞膜	保持完整	破损
染色质	凝聚在核膜下呈半月状	呈絮状
细胞器	无明显变化	肿胀、内质网崩解
细胞体积	固缩变小	肿胀变大
凋亡小体	有	无
基因组DNA	有控降解，电泳图谱呈梯状	随机降解，电泳图谱呈涂抹状
蛋白质合成	有	无
调节过程	受基因调控	被动进行

（二）生物学意义
①清除无用的、多余的细胞。无用的细胞大多在发育早期阶段即发生凋亡。如果发育过程中某些细胞产生过多，也会发生凋亡。例如，人胚胎肢芽发育过程中指(趾)间组织，通过细胞凋亡机制被清除而形成指(趾)间隙。
②清除受损、突变或衰老的细胞。受损不能修复的细胞通过凋亡而被清除。受病毒感染的细胞通过凋亡使DNA发生降解，整合于其中的病毒DNA也随之破坏，阻止了病毒复制。
（三）主要特征

凋亡细胞的主要特征是：①染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症；③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止；④核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状；⑤凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。

三、实验试剂与器材
1、洋葱内表皮细胞
2、染色液（改良苯酚品红染液）：
原液A：取3克碱性品红溶于100毫升70%酒精中，此液可以长期保存。
原液B：取A液10毫升加入90毫升5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2周内使用)。
原液C：取B液55毫升加入6毫升的冰醋酸和6毫升38%的甲醛(可长期保存)。
染色液：取C液10-20毫升，加入90-80毫升45%醋酸和1.5克山梨醇。
3、0.5M GaCl₂
4、光学显微镜、电炉、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片

四、实验步骤
1、材料准备
取新鲜洋葱室温下于清水中培养数小时，使其活化。
2、洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的诱导
从培养好的洋葱鳞茎上切取1 cm² 左右的内表皮，分成三组：
第一组是正对照，为正常细胞；
第二组是试验组，取10 片洋葱内表皮，于0. 5 M CaCl₂ 中培养10hr；
第三组是负对照，为煮沸5 min 的坏死细胞。
3、细胞凋亡的染色与观察
上述三组材料采用改良苯酚品红染液染色，20 min 后制片。光学显微镜下观察细胞的形态变化。