原位PCR技术基本原理、类型、步骤和应用-1

在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。

基本原理

原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。
PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。

原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。

基本类型

根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。
直接法原位PCR技术
直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺入到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中显现出来。
常用的标记物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。
直接法原位PCR技术的优点是操作简便，流程短，省时。缺点是特异性较差，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上，上述缺点更为突出。因为在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷进行修复，这样标记物就会掺入到DNA的非靶序列中，造成假阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。
间接法原位PCR技术
间接法原位 PCR技术师现在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显提高了特异性，是目前应用最为广泛的原位PCR技术。
间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术去检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交 (PCR in situ hybridization , PISH)。
间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是操作步骤较直接法繁琐。
原位反转录PCR技术。
原位反转录 PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是将液相的RT-PCR技术应用到组织细胞标本中的一种新技术，与RT-PCR（液相）不同点在于，进行原位反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破坏组织中的DNA酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。其它基本步骤与液相的RT-PCR相似。

基本步骤

原位PCR技术的基本步骤包括标本的制备。原位扩增（PCR）及原位检测等基本环节，现分述如下（重点以石蜡切片为例）。