DD-PCR技术

高等生物体内一般有105个基因，在这些基因中通常只有不到15％的基因得以表达，并且在生命代谢的不同阶段，在不同的环境条件下有不同的基因表达，基因表达差异性是生物体性状多样性，适应能力多样性的物质基础。对同一品种在不同环境条件下的基因差异表达研究，可以了解基因与性状间的关系，并进一步确定一些特殊的基因，dd－PCR技术是进年来发展起来的基因差异表达研究的手段之一。该技术利用mRNA3’端具有poly(A)的特点，以T12G、T12C、T12A为3’端引物扩增出cDNA；以10－mer的随机引物为5’引物进行PCR扩增，mRNA不同，随机引物结合位点不同，扩增后的条带长度也不同，通过测序胶电泳即可将差异表达的mRNA找出，进一步通过克隆或作为探针进行杂交即可获得差异基因。

一：仪器：PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备

二：试剂：T12G、T12C、T12A、10－mer的随机引物、RT－PCR试剂盒、测序胶、银染系统

三：操作：1：总RNA挑取见实验二

2：残留DNA的去除

（1） 按下表整备（2） 反应体系

1－5ugRNA

10×DNA酶缓冲液 2ul

RNA酶抑制剂 1ul

无RNA酶的DNase 1u

加DEPC水 至 20ul

混匀， 37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，0.3V3M乙酸钠，2V无水乙醇沉淀，冷冻干燥3：RT 5×RT缓冲液 4ul

0.2ug总RNA

10umT12N 1ul

加DEPC水 至 10ul

80℃ 1min 42℃ 5min 再加入

10mMdNTP 2ul

100mMDTT 1ul

50nMMgCL2 1.3ul

RNA酶抑制剂(40u/ul) 1ul

MMLV(200u/ul) 1ul

加DEPC水至 20ul

37℃ 1小时， 90℃ 1min

4：PCR 上述RT液 4ul

10×PCR缓冲液 1ul

25mM MgCL2 1ul 94℃ 1min

10mMdNTP 0.4ul 94℃ 30’

dT12M 0.2ul 40℃ 30’ 40循环

10mer随机引物 0.2ul 72℃ 45’

水 3.9ul 72℃ 6min

Taq酶（5u/ul） 0.1ul

混匀后，离心，再加上10ul石蜡油，按右边参数扩增。

5：检测 龈染检测，操作见实验十五

6：差异带切割、回收操作见实验八

7：回收差异带二次扩增

回收的差异带稀释 50－100倍

10×PCR缓冲液 1ul

25mM MgCL2 1ul 94℃ 1min 94℃ 45’

10mMdNTP 0.4ul 94℃ 45’ 42℃ 45’

dT12M 0.2ul 40℃ 45’ 72℃ 60’

10mer随机引物 0.2ul 72℃ 60’ 20循环

加水至 10ul 20循环 72℃ 6min

Taq酶（5u/ul） 0.1ul
8:PCR片断的再回收和克窿操作