细菌生长检测十大方法汇总-1

一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：
1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。
2、用台盼蓝（1％ Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10％小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。
3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40 IU/ml稀释到0.019 IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。
4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。
5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3％醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。
6、用dpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。

二、MTT检测法：
1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10％ SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

三、XTT检测法：
用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。

四、MTS检测法：
1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。
2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10％小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。
4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。
5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。

五、NAG检测法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。
3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
4、每孔加90μl终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长402nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

六、AlamarBlueTM摄入法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、在培养结束前24小时加入Alamar Blue染料，96孔细胞培养板每孔20μl。
3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570减去OD600即为活细胞还原的Alamar Blue染料，颜色深浅与活细胞数成正比。