作者:中华医学网
发布时间:2017-10-16 07:46浏览:
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直接荧光法是采用双功能螯合剂二乙三胺五乙酸-对氨基水杨酸(DTPA-PAS)与抗原或抗体偶联,免疫反应后,再加入适量的Tb3+,直接测量液相荧光强度。不需要预先制备Tb3+标记物,简化了操作步骤,但灵敏度较低,仅为10-9mol/l。为提高检测灵敏度,可以引入酶放大系统,以SA-碱性磷酸酶水解5-氟水杨酸磷酸酯,生成5-氟水杨酸,后者在高pH条件下,与Tb3+-EDTA-HCl形成高荧光强度的复合物,可直接测定。
(4)均相荧光测量法
均相荧光测量法是利用特殊的双功能螯合剂W1174,将Eu3+标记小分子活性物质,当与抗体结合后,免疫复合物对Eu3+荧光信号有显著增强或淬灭作用,故在测量前不必进行分离,就可直接测量液相中的荧光强度。该法省去了洗涤、分离和加增强液等烦琐的步骤,具有快速、方便等优点,但不足之处是需要特殊螯合剂。
(5)协同荧光测量法
协同荧光测量法是利用一些不发荧光的稀土离子,如Cd3+、Y3+、La3+、Lu3+等,能使发荧光的稀土离子的荧光信号大大增强。在免疫分析体系中,pH值为6.0-8.0时,它们的荧光强度最大,有利于提高检测的灵敏度。此外,此法可以对一分样品中不同组分含量进行同时测量。但需要特殊的增强液,同时Cd3+、Y3+、La3+、Lu3等稀土离子的纯度对测量结果有明显影响。
四、时间分辨荧光免疫分析的应用
时间分辨荧光免疫分析可用来检测生物活性物质,特别是在生物样品免疫分析中,显示出它愈来愈多的独特优点。在内分泌激素的检测,肿瘤标志物的检测,抗体检测,病毒抗原分析,药物代谢分析以及各种体内或外源性超微量物质的分析中,应用TRFIA法越来越普遍。近年来,已将这项技术应用于核酸探针分析和细胞活性分析、生物大分子分析,发展十分迅速。
(1)TRFIA法在内分泌学中的应用
内分泌激素是一些活性小分子,它们能与适当的抗体反应,具有免疫反应性,但不能产生抗体,不具有免疫原性,它们属于半抗原。对这些半抗原的测定,一般多用竞争性时间分辨荧光免疫法测定。这方面的测定主要有血清中孕酮 [3]、雌二醇 [4]、睾酮 [5]、甲状腺激素 [6]、前列腺素[7]的测定等等。
(2)TRFIA在肿瘤学中的应用
对一些完全抗原,它们大多是既有免疫反应性又有免疫原性的蛋白质类,主要包括促甲状腺激素[8]、血清胰岛素[9]、血清癌胚抗原[10-11]、血清甲胎蛋白[12]、乙型肝炎表面抗原[13]等,主要采用非竞争性TRFIA法进行测定。
(3)TRFIA法在免疫学中的应用
某些免疫细胞(如NK、LAK、T杀伤细胞等)的活性,可以用TRFIA法来检测。如Blomberg[14]等用该方法测定了NK细胞的活性;Granberg[15]等用TRFIA法测定杀伤性T淋巴细胞活性;Volgmann[16]等测定了LAK细胞的活性;Maley[17]用 TRFIA法测定细胞介导的、补体介导以及抗体依赖的细胞活性;Lovgren和Blomberg[18]用此法同时测定两种靶细胞的活性;陈泮藻 [19]等也用此法测定了T淋巴细胞的活性。这些测定均取得了良好的结果。
(4)TRFIA法在微生物学中的应用
由于TRFIA技术具有灵敏度高和特异性强的特点,TRFIA法在微生物检测和分析中的应用日益广泛和深入。目前TRFIA已广泛应用于乙型肝炎病毒、脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、副粘病毒、风疹病毒、马铃薯病毒、轮状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、出血热病毒和梅毒螺旋体的抗原抗体以及某些细菌和寄生虫抗体的检测[2]。最近,潘利华[20]等用TRFIA法进行了人血清中丙型肝炎病毒抗体(Anti-HCV)的检测,效果明显高于酶联免疫法。
五、展望
时间分辨荧光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、所用试剂有良好的稳定性、检测限较宽、尤其是能消除常规荧光测定中的高背景等优点,是非放射免疫分析中很有发展潜力的分析方法。有关研究论文约占免疫分析文献的10%-15%。寻找、设计并合成出较理想的镧系元素螯合物探针;改进标记技术和简化分离技术;采用多重标记法进行放大,进一步提高灵敏度以及提高检测手段的程序化,进一步提高信噪比将成为时间分辨荧光免疫分析的发展方向。