作者：中华医学网发布时间：2017-10-15 22:10浏览：
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三、电泳
1.makegel．
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11%分离胶 12ml 两块胶 |
4%积层胶6ml两块胶 |
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DW4.36 ml |
DW堵漏3.66ml |
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3M Tris3.0 ml |
0.5M Tris1.5 ml |
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30%Arc4.4 ml |
30%Arc0.5 ml0.78 ml |
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10% SDS0.24 ml |
10%SDS60 ul |
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10%APS0.12 ml |
10%APS20ul30 ul |
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TEMED10ul |
TEMED5ul6ul |
2.上样前样品处理：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30S。
3.通电电：积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4.考马斯亮蓝染色：1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。
四、电转印
1. 将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟。
2.转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极，20V恒压转移12小时。取下NcM杂交，凝胶染色看效果。
五、杂交
1. 取下NcM，做好标记，dH2O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。
2.NcM用PBS冲洗二遍，呈 5～6%non－fatmilk的pH7.2的PBS中封闭，室温６－８小时或室温1－2小时，4℃，过夜。
3.将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。
4.加入一抗1:1000－1200，室温，反应1小时
5.PBS洗15分钟×1，15分钟×4。
6. 加入二抗1:5000，室温，反应1小时。
7.PBS洗15分钟×1，5分钟×4。
六、化学发光试剂检测
1. 混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。
2.放射自显影：曝光3分钟至10分钟。
3.显影后清水漂洗，再定影。
七、所用试剂
1、匀浆缓冲液4×1L：
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NaH2PO4（·H2O） |
12.48g |
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Na2PO4·12H2O |
114.6g |
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NaCl |
3.6g |
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dw 800ml, adjustpHto7.0,adjustVolto1 L |
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（1）用时稀释4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛 血清蛋白浓度稀释法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
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500ug / ml BSA |
NS |
蛋白浓度ug / ml |
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S1 |
50 ul |
1.95 ml |
12.5 |
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S2 |
100 ul |
1.90 ml |
25 |
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S3 |
200 ul |
1.80 ml |
50 |
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S4 |
400 ul |
1.60 ml |
100 |
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S5 |
800 ul |
1.20 ml |
200 |
3. 30%Acrylamide
29.2g单丙、0.8g双丙溶解于60 mlDDW，调Vol到100 ml
4. 3M Tris－Hcl buffer pH 8.9 100ml.
称Tris 36.3g溶于水到100 ml，调pH到8.9
5. 0.5 M Tris－Hcl buffer pH 6.7 100ml
称Tris5.98g溶解后，调pH到6.7，调体积到100ml
6. Samples buffer 10ml
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10%SDS |
2 ml |
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甘油 |
1 ml |
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0.5MTris |
1.6 ml |
用前按9 : 0.5 : 加0.1溴酚兰、0.5% DTT贮备液。 |
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DDW |
5.2 ml |
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7.电转液1LpH 8.2－8.3
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Glycine |
14.42 g |
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Trisbase |
3.02 g |
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dH2O |
800 ml |
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Methanol |
200 ml |
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10% SDS |
2 ml |
8.pH 7.2PBS2 L
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NaCl |
18.0g |
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KCl |
0.44g |
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Na2HPO4 |
2.84g（7.16g） |
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NaH2PO4 |
0.432g（0.562g） |
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加DW到2 L |
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9.10×电极缓冲液400 mlpH 8.4
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Tris base |
12.2 g |
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甘氨酸 |
57.76 g |
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加DW 400 ml, 调pH8.4，用前加SDS0.1% |
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10.脱色液1号
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甲醇 |
250 ml |
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冰醋酸 |
50 ml |
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＋DW到500 ml |
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11.脱色液2号
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甲醇 |
100 ml |
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冰醋酸 |
75 ml |
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＋DW到1000 ml |
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