Real-time PCR实验心得和RNA提取心得

并不是所有的实验都可以做real－time的，技术路线要选好

当你的基因表达量少或有些不表达

具体就是做普通pcr跑胶条带比较弱，不是很亮的情况下

个人觉得最好不要选择real，不容易做好，特别是融解曲线

用sbgr green染料做的话，引物设计时扩增片断最好小于250bp，太长了不好扩

预实验先rt－pcr，梯度温度扩增，寻求最佳退火温度。

并确定有较亮的目的条带

试剂盒不能太差，要省钱的话可以把体系降到20ul

最好不要用普通的pcr试剂盒＋sbgr green来作real，

可以做出来，但是不稳定，很耗时间精力

上下游引物可以混在一起，摸条件时加样比较方便，如果要批量的话，最好是分开的好些。

如果用的是普通pcr的ep管，可以把盖子剪掉，再加入20ul的石蜡油或矿物油封住液面，效果比较好，当然要确定你的机子是从盖子上面检测荧光的，而不是从侧管壁。

融解曲线不好，特别是有目的条带高峰，但前面65－75度峰也较高时，可以再做一次融解曲线，一般都会变好一点，不过最好是把条件优化

重做融解的对比图，有时候这是机子，还有荧光的不稳定造成的
Real比较敏感，融解曲线不太好的时候，电泳结果也可以，所以对引物设计要求高些。如果条件优化很多次都好不了，那最好就换个引物了
附RNA提取心得

提取步骤：invitrogen的RNA提取试剂盒trizol，红色，100ml

1，取组织50－100mg，加入trizol试剂1ml，剪碎组织块，匀浆5－15分钟，后放室温裂解5分钟

2，4度，12000rpm离心10分钟，换新ep管，取上清

3，按200ul/ml的trizol加入氯仿（1/5的体积），手动剧烈振荡15秒，后室温放置3分钟

4，4度，12000rpm离心15分钟

5，取上清至新ep管，注意少震动，少吸，一般400ul，不能吸入中间絮状物质

6，按500ul/ml的trizol（等体积的，那就是400ul）的加入异丙醇（预冷），室温10分钟

7，4度，12000rpm离心10分钟，弃上清，应该可以见到白色沉淀

8，加入75%的乙醇1ml洗涤，悬浮沉淀

9，4度，7500rpm离心5分钟

10， 去上清，风干，5分钟左右

11， 加入DEPC处理过的无酶水20－40ul，吹打融解沉淀，－70度保存

如果不是提特殊组织（如胰腺），好像也不是很难提，RNA也不是那么容易降解的。

我们经常口罩帽子都不戴，也没事。但是关键步骤一定要注意，小心。

组织要匀浆好，可以把组织剪碎，剪刀我们也没处理，尽快吧，加入trizol以后就没事了，它可以抑制RNA降解的。一般就4－5分钟，组织块成白色的就行了。室温裂解可以多放几分钟。

第5步比较关键，中间层一定不要吸。操作要轻柔，防止中间层飘起。

第7步就可以看见沉淀了，沉淀多，后面的水就多加些（40ul），如果没看见沉淀，加水10ul就可以了，有些是有的，只是量太少了看不见。

提RNA最好一次提完，也就3个小时左右，不要提一半后保存

提完后测个浓度尽快逆转录

我们没跑电泳，后面也可以做