实时定量PCR技术综述（原理、荧光标记、TaqMan Probes和Hybridiz

四.Hybridization Probes技术要点
Hybridization探针技术要求所用的热稳定 DNA聚合酶没有5’→3’外切酶活性,以保证探针有恒定的浓度并能反复与模板杂交。
Jochen,Wilhelm等（2001）研究了Taq酶 5’→3’外切酶活性对基于Hybridization探针技术的定量PCR的影响，认为：（１）Taq酶5’→3’外切酶活性降解了部分探针；（２）Taq酶的stoffel片段（去除N端289个 氨基酸）不具有5’→3’外切酶活性，其在高浓度Mg²⁺存在下，能获得较好的PCR动力学曲线（如下图）；（３）stoffel片段因高Mg²⁺浓度造成的非特异性扩增可采用加入TaqStart antibody的方式消除。

五.TaqMan 探针与Hybridization探针技术的比较
1. Hybridization探针技术的特异性高于TaqMan探针，因其信号的产生依赖于两个独立探针的特异性。但其在探针设计上需要更多的可选序列；

2. TaqMan探针技术的开放性优于Hybridization探针技术，原因有二：（１）TaqMan探针技术的荧光标记系统是开放的，易从第三方获得，而Hybridization探针的荧光染料为罗氏专有，易受其控制；（２）TaqMan探针和Hybridization探针分别在ABI Prism7700和罗氏LightCycler上建立，因荧光标记和仪器检测波长的不同，限制了其在两种仪器上的通用性，目前已有文献报道将 TaqMan探针用在LightCycler上，但未见报道Hybridization探针用在ABI Prism7700上，可能是ABI Prism7700价格较贵，不适合临床应用，而ABI GeneAmp 5700SDS只有一个检测波长（530nm）；也可能Hybridization探针依赖于LightCycler的快速扩增。
3. Hybridization 探针分别标记两个探针，和TaqMan探针的同一探针三种修饰相比，修饰技术要求低，对修饰的质量控制更有利。