作者：中华医学网发布时间：2017-10-15 19:07浏览：
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（2）引物：
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引物 |
序列（5’～3’） |
位置 |
片段（bp） |
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逆转录引物 |
TAGTAGTAGACTCC |
1~14 |
LMS |
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通用外引物 |
AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG |
1910~1939 |
M(+) |
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GTACAICCTGTRCCIACCCC |
2373~2354 |
M(-) |
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型特异性引物 |
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汉滩病毒 |
GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC |
1958~1984 |
M(+) |
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GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC |
2318~2340 |
M(－) |
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汉城病毒 |
GTGGACTCTTCTTCTCATTATT |
1936~1957 |
M(+) |
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TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG |
2331~2353 |
M(－) |
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S片段引物 |
ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG |
1200~1220 |
S(+) |
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GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA |
1670~1696 |
S(-) |
方法：
1）病毒RNA的提取：采用TRIzol按说明提取，制备模板RNA；
（2）逆转录、合成cDNA：采用 SuperScripTMII或AMV逆转录酶，按说明书进行；
（3）PCR扩增：反应条件为95℃预变性10分钟，94℃60秒、55℃60 秒、72℃45秒、扩增30～35个循环，72℃延伸12分钟。
（4）扩增产物用1～2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。若条带的分子量与预期片段大小相同，则表明为特异性扩增产物。
必要时，可进行：
（5）PCR片段的回收和核苷酸序列测定：切下特异分子量条带，用QIAquick凝胶回收试剂盒回收（按其说明书进行），自动测序仪测序。
意义：扩增到特异性条带可确诊汉坦病毒并明确其型别，序列测定还可以对汉坦病毒的变异情况进行研究。