胶体金标记蛋白A技术（Protein A-gold technique, PAg法）-2

(2)0、5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl约420m1，调pH值至7.4，最后加双蒸水至1000m1，此为储备液。

(3)0、05mo1／L Tris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1；加双蒸水至1000m1，调pH值至7.4.

(4)0、02mo1／LTris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1，加双蒸水至 l000m1，调pH值至8.2.

(5)0、5mo1／L，Triton-Tris缓冲生理盐水：Tritonx-100 l0m1;0.5mo1／L，pH7.4 Tris- Hcl缓冲液100m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至7.4.

２、具体步骤:

(1)0、05mo1／L TBS(pH7.4)洗5min×3次。

(3)1：5正常羊血清(0.05mo1／L TBS PH7.4)37℃孵育l h，阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。

(4)特异性一抗(抗体稀释度较常规免疫组化低l倍)室温孵育24h.

(5)0、05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。

(6)0、02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。

(7)1：5正常羊血清(0.02mo1／L TBS pH8.2)37℃孵育l h，再次阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。

(8)生物素化胶体金标记二抗(原液)37℃孵育2h.

(9)0、02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。

(10)0、05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。

(11)最后切片浸于o．05m01／L TBS pH7．4缓冲液中，送电镜室处理。

无DNA酶的胰RNA酶 将胰RNA酶溶解于10mmol/LTris-Hcl(PH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，与100度加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份－20度保存。

３、病毒液体的胶体金技术

（自：傅仓生，胶体金免疫电镜技术用于烟草花叶病毒的检测，植物病理学报，VoL．24，No．4，353—355）1.3.1 外标记标本制备： (1)以带膜铜网蘸取纯化病毒悬液，PBS冲洗。(2)在相应的抗血清中室温孵育20分钟，PBS冲洗。(3)在PAg(1：50稀释)中室温孵育 20分钟，PBS冲洗。(4)1％醋酸铀负染，H500电镜观察，拍照。

内标记标本制备： (1)以感染烟草花叶病毒的普通烟叶的试料，电镜常规制样，超薄切片。(2)在TMV抗血清中室温孵育l小时，PBS冲洗数次。(3)在PAg(1：50稀释)中室温孵育1小时，PBS冲洗数次，三蒸水冲洗数次。(4)醋酸铀一柠檬酸铅双染色，H500电镜观察，拍照。

（自：翟雷，朴晓萍，潘萍等。微生物学免疫学进展，1995，24（3）：17-19.免疫胶体金试剂的制备及应用胶体金免疫电镜技术检测戊型肝炎病毒）取样品100 ul分别于微量离心管，各加100 ul鼠抗HEV单克隆抗体(1：500一1000稀释)，混匀， 37℃温箱作用60min，双蒸水充满管，13000 rPm离心30 min，弃上清。沉淀用100 ul双蒸水悬浮，加l00ul胶体金标记免抗鼠IgG，温匀，置37℃温箱作用 60 min．双蒸水充满管，13000rPm离心30min，弃上清，沉淀用l00ul双蒸水悬浮，滴于镀膜铜网，干后3％PH7.4的PTA负染，电镜观察。

（自：滴一滴NDV于铜网上，室温吸附15分钟，然后用0.1％的PBS洗5次，吸去余液；加一滴金标抗体于铜网上，37度作用20分钟，PBS洗 5次，吸去余液，然后用磷钨酸负染5分钟，干燥后电镜观察。

（自：梁红，谭红英，蔡景霞等。蛋白A胶体金免疫电镜负染技术检测脊髓灰质炎病毒和SV40病毒，中华微生物和免疫学杂志，1998，9（2）：111－112） 取抗原抗体各50UL在血凝板孔中37度，45分钟。加OD值为0.2胶体金50UL，37度，45分钟。取抗原抗体胶体金混和物50UL，于铜网，室温30分钟。胶体金缓冲液洗两次，双蒸水洗一次，磷钨酸负染，电镜检查。