作者:中华医学网
发布时间:2017-10-15 11:08浏览:
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表 免疫渗滤分析和免疫层析分析的比较
免疫渗滤分析(穿透滤过型) | 免疫层析分析(横向流动型) | |
硝酸纤维素膜的种类及形式组成方式 | 为圆片膜,孔径0.2-0.4µm较简单,由载有配体( 抗体或抗原)的硝酸纤维素膜片及底层的吸水垫料组成 | 为窄长型膜,依灵敏度及流速的要求,选用孔径不同的合适的膜。自下端至上端(由左至右)由:(1)样品垫 (sample pad) (2)载有固相标记配体 抗体(或抗原)的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条(conjugate release membrane) (3)合适孔径的硝酸纤维素膜条(喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线,和阴性对照组线)(ni-trocellulose memtrane)4. 吸水垫(absorbent pad)等四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上(back sheet) |
标记配体的形式 | 为液相形式 | 根据需要及可能可设计同时 大多数为固相形式 |
多功能性 | 测定一种以上分析物加样、洗涤、加标记 | 同左 |
操作步骤 | 配体及洗涤等步骤 | 大多数只有加样一个步骤 |
注: 以上标记配体均为胶体金或硒标记、分散型染料标记等。如为酶标记则二者都必须增加“加显色底物”的步骤
二、标记物的种类
标记物包括、胶体金属(胶体金,胶体硒)、分散型染料(disperse dyes)和染料标记的微球(latex particles)等,标记物各有优缺点,可根据以下的标准选择,如:灵敏度,所需要的颜色,分析的模式和操作步骤,制备、保证重复性、急定性及规模及的难易程度和重复性,以及标记物所需配体量等。其中酶虽然有高灵敏度,重复性好及标记物易规模化等优点,但它需要洗涤,加底物等步骤,需要反应的时间也长些,对技术也有一些要求,故未能作为快速诊断的主要标记物(1985年最初的免疫渗滤分析是以酶作为标记物)。目前应用最广泛的标记物为胶体金,包括:胶体金免疫渗滤分析(gold immumofiltraition assay GIFA)或滴金免疫分析和胶体金免疫层析分析(gold immunochromatography assay , GICA)。由于GICA更简便快速,已成为目前最主要的快速免疫分析方法之一。
三、原理
胶体金免疫渗滤分析(GIFA)原理与操作步骤基本与ELISA相同:加样品于固定有配体(抗体或抗原,此处以抗体为例,下同)的硝酸纤维素膜上,通过渗滤在膜中形成抗体-抗原复合物,洗涤渗滤后,再加液体的胶体金标记抗体。当结果为阳性时,在膜上固定有抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。胶体金免疫层析分析CICA原理与GIFA相同,只是操作步骤有所不同,如反应液体流动方向由垂直渗滤改为横向层析流动(见表):样品加样品垫(1)上,样品向吸水垫(4)方向流动,途径载有固相胶体金标记抗体膜(2)后,将金标记物完全复溶,抗原与金标记抗体形成金标记抗体-抗原复合物,继续向前流动至硝酸纤维素膜条(3)上,固定有捕捉抗原的抗体线处。当结果为阳性时,金标记抗体-抗原复合物上,就会形成金标记抗体-抗原-固相抗体复合物,呈现红色阳性条带;如样品中无抗原,则不被捕获,就不显色,则结果为阴性。多余的游离金标记抗体继续前移至固定有抗金标记体二抗处,被固定呈现红色的阴性对照。GICA与GIFA不同之处在于后者只是单一的免疫层析条,不需要其它试剂,一步操作。二者与ELISA不同处是反应时间大大缩短,仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中,高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用(immunoconcentraiton)。在ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物,故需时间较长。