果蝇类标本的辣根过氧化物酶标记试剂染色检测

酶标试剂的检测是利用可溶性的色原物质经酶促作用发生沉淀反应，在酶反应部位产生不溶性的有色物质(Avrameas and Vriel 1996；Nakane and Pierce 1967 d，b；Avrameasl972)。每种酶可利用一定范围的底物，但对于原位染色，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)适应大多数实验的要求。HRP标记的各种试剂均可购买到。用HRP可以标记抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G、亲和素或链霉亲和素等。

HRP标记的试剂：HRP的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、氯奈酚和胺乙基卡巴砷，但在果蝇类免疫定位中最有用的底物是DAB／金属盐。DAB也是HRP最敏感的底物之一，可产生一种高密度的棕色物质，不溶于水和醇类。在大多数情况下，建议在DAB底物溶液中加入金属离子，如加入金属盐类钴、镍等，可使其变得更加敏感，其反应产物是蓝灰色至黑色，并且在水和醇中是稳定的。DAB／金属盐类染色适合于大范围的标本检测。

1．对照
特异性染色反应需要与对照进行比较。为了准确评价染色模式，应对来自同一种属的两种抗体进行比较。对于多克隆抗体来说，最好的对照是从用于制备特异性抗体的同一动物免疫前采集的血清，但亦可以使用来自相同种属动物的非免疫血清。对于单克隆抗体来说，对照应该是与特异性抗体的来源相同；例如，杂交瘤细胞培养上清对比上清，小鼠腹水对比腹水，纯化抗体对比纯化抗体。对照抗体应该与特异性抗体的类和亚类相同。来自亲代骨髓瘤的细胞培养上清不宜作为对照，因为其中不含抗体。适宜的对照杂交瘤细胞株可从美国ATCC或欧洲动物细胞培养保藏中心获得。
此外，对二级试剂应进行检测。当采用酶标染色检测时，应设立不加任何抗体的酶反应对照。这将有助于证实任何内源性酶活性的存在和分布位置。

2．准备工作
进行抗体结合和检测最重要的准备工作是进行一抗和二抗的滴度测定。虽然在下述方法中建议抗体的加入初始量，但在免疫染色中应调整一抗、二抗的用量，以便达到足以引起强大有效信号的最低浓度，以免发生非特异性染色。对每一种抗体(存在于蛋白缓冲液中，如1％IgG／)做一系列稀释度并观察其对靶细胞的染色效应。1／3稀释(一份抗体中加入两份缓冲液)将接近其半对数值，并对所加入量进行合适的快速测定。对于第一抗体的每一个滴度测定应进行重复实验。而二抗一旦确定其稀释度，就可以作为该批抗体的标准用量。
如有可能，应该对携带所研究抗原基因缺失的果蝇类标本同时进行染色。这将为特异性抗体提供一个极好的遗传对照。

3．所需溶液与试剂
第一抗体溶液；第二抗体(多数来自商品试剂)；；含1％正常羊IgG的；二氨基联苯胺(DAB)；0．05mol／LTris缓冲液(pH7．6)；0．3％(W／V)NiCl贮存液(溶于水中)；30％过氧化氢；50：50甘油：混合物；70：30甘油：混合物。

4．特殊设备
解剖显微镜；光学显微镜(多数带有相机，以便于拍摄结果)。