层析技术(Layer-analise technique)(3)

3．平衡 将DEAE―纤维素放入0.0lMol/L pH 7.4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。

4．装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10：1～20：1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。

装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。

5．上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。

样品的加量与DEAE―纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的 ―球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。

6．洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。

表1－5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系

 

成 分	等电点	DEAE吸附能力	解吸顺序
白蛋白	4.9 5.6 5.1 7.3	强     弱	后     先

表1－6 血清的分段洗脱成分

 

NaCl浓度（Mol/L）	0.01Mol/L PB（pH）	洗脱部分
0.025	8.0	IgG
0.030	7.0	IgG
0.040	7.0	运铁蛋白、纤维蛋白原
0.060	6.5	白蛋白、IgA
0.150	6.5	IgM 白蛋白

表1－7 各种Ig解脱吸附条件

 

不加NaCl PB离子强度（Mol/L）	pH	Ig	其他
0.01	8.0	IgG
0.025	8.0	IgE
0.035	7.0	IgA
0.040	5.9		球蛋白
0.10	5.8		白蛋白
0.40	5.2~4.5	IgM	球蛋白

7．洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。

8．交换柱的再生 将使用过的DEAE－纤维素移入 烧杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加1/10 000的叠氮钠防腐，保存于4℃冰箱中。使用时，再以碱－酸－碱处理