层析技术(Layer-analise technique)(2)

离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；②离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。

 

2．离子交换交联葡聚糖 离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。

表1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性

类 型	性 能	离子基因	反离子	总交换容量 （毫克当量/g）
DEAE-sephadexA-25	弱碱性、阴离子交换剂	DEAE+	Cl―	3.5±0.5
DEAE-sephadexA-50
QAE-sephadex-25	弱碱性、阴离子交换剂	QAE+	Cl―	3.0±0.4
QAE-sephadex A-50
CM-A- sephadex 25	弱碱性、阳离子交换剂	CM―	Na+	4.5±0.5
CM- sephadex A-50
SP- sephadex A-25	强碱性、阳离子交换剂	SP―	Na+	2.3±0.3
SP- sephadex A-50

离子交换交联葡聚糖有如下优点：①不会引起被分离物质的变性或失活；②非特异性吸附少；③交换容量大。

离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般选A₅₀ 和C₅₀ ，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜选用A₂₅ 和C₂₅ 。

（三）试验方法

阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。

1．剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE^-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。

下面以DEAE^-纤维素操作为例，介绍试验方法

2．膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE^-纤维素上的极性基团。DEAE^-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE^-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。

表1－4 分离的血清与所需DEAE―纤维素量及其他条件的大致关系

血清样品量（ml）	DEAE需用量（g）	选层析柱规格（cm）	选脱液量（ml）
1~2	2	1×25	100~150
5	5	2×12	200~300
10	10	2×20	300~400
20	20	2×37	400~800

称取所需的量 ，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE―纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。