3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖

【原理】 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系。在540nm波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。
【仪器与用具】
25ml血糖管或刻度试管；大离心管或玻璃漏斗；100ml烧杯；100ml三角瓶；100ml容量瓶 ；刻度吸管 1ml、2ml、10ml；沸水浴；离心机（过滤法不用此设备）；电子天平；分光光度计。

【试剂】
（1）1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。
【方法】
1．制作葡萄糖标准曲线
取7支具有25ml刻度的血糖管或刻度试管，编号，按表24-2所示的量，精确加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。
将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5ml蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖mg为横坐标，绘制标准曲线，求得直线方程。

表24-2 各试管加溶液和试剂的量

 

管 号	0	1	2	3	4	5	6
葡萄糖标准液(ml)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2
蒸馏水（ml）	2.0	1.8	1.6	1.4	1.2	1.0	0.8
3,5-二硝基水杨酸试剂（ml）	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
相当葡萄糖量(mg)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2

2．样品中还原糖的测定

（1）样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100ml的烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

（2）显色和比色：取3支25ml刻度试管，编号，分别加入还原糖待测液2ml，3,5-二硝基水杨酸试剂1.5ml，其余操作均与制作标准曲线相同，测定各管的消光值。分别在标准曲线上查出相应还原糖mg数，按下式计算还原糖百分含量：

还原糖（%）= [C×(V/a)]/(W×10³)×100

式中 C－标准曲线方程求得的还原糖mg数；

V－提取液的体积（ml）；

a－显色时吸取样品液体积（ml）；

W－样品重（g）。