植物组织中总糖及还原糖的测定—3,5-二硝基水杨酸比色法

一、实验目的：
1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理。
2、掌握比色法测定还原糖的操作方法。
二、实验原理:
1、还原糖：指含有游离的半缩醛(酮)基糖。
单糖都是还原糖；某些二糖是还原糖（如麦芽糖、乳糖等）；多糖为非还原糖。
2、总糖的提取及双、多糖的酸水解。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
3、还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
在碱性条件下，还原糖与DNS试剂反应，还原糖被氧化成糖酸及其它产物，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

4、在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质(3-氨基-5-硝基水杨酸)颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：食用面粉、大豆叶片
2、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。
3、试剂：
（1）500μg/mL 葡萄糖标准液
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂(碱性)
（3）6M HCl和6M NaOH
四、实验步骤：
1、葡萄糖标准曲线的绘制:取7支试管，按下表操作，以标准葡萄糖含量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、还原糖的提取
①取0.5g样品于研钵中，加水2-3ml，充分研磨。
②用15ml蒸馏水分三次冲洗研钵，转入50ml锥形瓶中。
③ 在50℃水浴中恒温20分钟，冷却后于3000转离心5分钟。
④取上清转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，待测。
3、总糖的水解及提取
① 取0.5g样品于研钵中，加水2ml，充分研磨。
②用6ml蒸馏水分三次冲洗研钵，转入50ml锥形瓶中。
③向锥形瓶中加入10mL 6M HCl，沸水浴30分钟，冷却后，用6mol/LNaOH调pH值至中性，于3000转离心5分钟。
④取上清转入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容，待测。
4、样品含糖量的测定:
取提取液0.5ml，按上表操作。