淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对酶活性的影响

原理

酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。

操作方法

一、唾液淀粉酶的收集与处理
1.制备唾液
实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。
2.煮沸唾液
取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。
3.稀释唾液
调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：
①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。
②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。
③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察

（一）取试管3支编号，按下表1操作

表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察

 

试剂   试管	pH6.8缓冲液	1％淀粉溶液	1％蔗糖溶液	制备唾液	煮沸唾液
1	20滴	10滴	－	5滴	－
2	20滴	10滴	－	－	5滴
3	20滴	－	10滴	5滴	－

　将上述各管混匀后 置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。

（二）温度影响酶促反应的实验观察

1.取试管3支编号，按下表2操作：表2 温度影响酶促反应的实验观察

 

 

管号   试剂	1	2	3
1.pH6.8缓冲液	20滴	20滴	20滴
2.1％淀粉溶液	10滴	10滴	10滴
3.预热5min	37℃水浴	沸水浴	冰浴
4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时	5滴	5滴	5滴
5.保温10min	37℃水浴	沸水浴	冰浴

　2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。

 

四、pH影响酶促反应的实验观察

1. 取试管3支编号，按下表3操作：

表3 pH影响酶促反应的实验观察

 

	pH4.0缓冲液	pH6.8缓冲液	pH8.0缓冲液	1％淀粉溶液	稀释唾液
试管1	20滴	－	－	10滴	5滴
试管2	－	20滴	－	10滴	5滴
试管3	－	－	20滴	10滴	5滴

　2.将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明pH对酶促反应的影响。

五、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

 

1. 取试管4支编号，按下操作：

表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

 

	pH 6.8   缓冲液	1％淀粉溶液	蒸馏水	0.9％NaCl	1％   CuSO4	1％Na2SO4	稀释唾液
1	20滴	10滴	10滴	－	－	－	5滴
2	20滴	10滴	－	10滴	－	－	5滴
3	20滴	10滴	－	－	10滴	－	5滴
4	20滴	10滴	－	－	－	10滴	5滴

　2. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观各管颜色的区别，并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。

 

注意事项

1.反应试管应清洗干净，不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用；

2.使用混合唾液，或通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。

 

试剂和器材

一、器材
1.滴管、烧杯、试管（架）及试管夹。
2.恒温水浴箱与水浴锅。
3.脱脂棉、漏斗及纱布。
4.白瓷反应盘

二、试剂

1.1％淀粉称取淀粉1g，加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100m1。

2.1％蔗糖溶液
3.班氏试剂 A液：取柠檬酸钠173ｇ，无水碳酸钠100ｇ，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：取结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O）17.3ｇ溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。

4.碘液：称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。
5.各种pH缓冲液
⑴pH6.8缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。
⑵ pH4.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。
⑶ pH8.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。6.0.9％ NaCl 溶液
7.1％CuSO4 溶液
8.1％Na2SO4溶液