乳酸脱氢酶同工酶的分离(琼脂糖凝胶电泳法)

一 原理：
来源于同一个体或组织，能催化同一反应，而蛋白结构不同的酶称为同工酶。
　　同工酶的蛋白结构有差别，它们的理化性质也就有所差异。因此可用电泳或其它方法将它们分离开来。例如乳酸脱氢酶(LDH)同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，但经电泳法分离后，就有5个同工酶区带。
　　由于同工酶在不同组织，器官中的分布不同，即具有组织器官的特点。因此已利用同工酶的酶谱作临床诊断的依据，也被利用于生物分类及遗传育种等工作中。
　　本实验用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱氢酶5个同工酶(LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5)。
　　血清乳酸脱氢酶的辅酶是NAD+,当乳酸脱氢酶催化乳酸脱氢时, NAD+ 即被还原成NADH + H+。

二 试剂：
1、巴比妥—HCl缓冲液(pH8.4 0.1M)：溶17.0g巴比妥钠于600ml水，加入1M HCl溶液23.5ml，再加蒸馏水至1000ml。
2、0.5M乳酸钠溶液：60%乳酸钠10ml，溶于蒸馏水并稀释到100ml。
3、0.001M EDTA－Na2(乙二胺四乙酸钠盐)溶液：称取EDTA－Na2·H2O 372mg，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
4、0.5％琼脂糖凝胶：溶50mg琼脂糖于5ml巴比妥—HCl缓冲液(pH8.4，0.1M)，加蒸馏水5ml，沸水浴加热，待琼脂糖溶化后，再加 0.001M EDTA－Na2溶液0.2ml，保存于冰箱中备用。
5、显色液：溶50ml NBT(硝基蓝四唑)于20ml蒸馏水(25ml棕色量瓶)，溶解后，加入NAD+125mg 及PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)12.5mg，再加蒸馏水至25ml，该溶液应避光低温保存，一周内有效，如溶液呈绿色，即失效。
6、电泳用缓冲液(pH8.6，0.075M)：巴比妥钠15.45g，巴比妥2.76g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。

三 器材：
l、人血清 　　　　　2、载玻片
3、电泳槽及电泳仪 　4、镊子

四 操作步骤：

1、琼脂糖凝胶的制备和电泳：将0.5％琼脂糖凝胶在水浴中加温溶化。取溶化的凝胶液平浇于一洁净的电泳装置中的凝胶板上(板的两端用透明胶带封好)约2cm厚，插入加样梳，放在水平台上冷却，凝胶凝固后，剥去胶带，小心拔去加样梳，将凝胶板放在电泳槽内，用微量加样器加入适量血清样品，样品端接负极，电泳90分钟，电流30mA。

2、显色：电泳终止前10分钟，取巴比妥 —HCl缓冲液6.7ml与显色液5.3ml及0.5M乳酸钠溶液2ml混匀,放入培养皿，将电泳结束后的凝胶放入培养皿中 37℃避光保温半小时，即显示出五条深浅不等的蓝紫色区带。最靠近阳极端的是LDH1，依次为LDH2、LDH3、LDH4和LDH5。由于正常人血清乳酸脱氢酶各同工酶的百分比是：LDH1 33.4%，LDH2 42.8%，LDH3 18.5%，LDH4 3.9%，LDH51.4%，故靠近正极的三条区带最明显，而LDH4和LDH5几乎不易观察到。