[实验步骤]
1、电泳槽与薄膜的制备
(1)醋酸纤维素薄膜的湿润与选择
用钝头镊子取一片薄膜,在薄膜无光泽面上,距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。
小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s— 30s内迅速湿润,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳;若薄膜湿润缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点,则表示薄膜厚薄不均匀应舍去,以免影响电泳结果,将选好的薄膜用竹夹子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。
(2)电泳槽的准备
根据电泳槽的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中,各倒等体积的电极缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素膜的桥梁,因而称为滤纸桥。
2、点样
用钝头镊子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液,无光泽面向上平放在点样板上,点样时用点样器沾少许血清,再将点样器轻轻印在点样区内,样品线长度一般为1.5cm,宽度一般不超过3mm如图1-2-8所示,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线,此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后在正式点样。
图 1-2-8醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图,虚线处为点样位置。
3、电泳
用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上。如图1-2-9所示,要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂,如一电泳槽同时安放几张薄膜,则薄膜之间应隔几毫米,盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。
用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接,注意不要接错。在室温下电泳,打开电源开关,调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA(8块薄膜则为4.8mA)。通电10min—15min 后,将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8mA),电泳时间约50min—60min。电泳后调节旋钮使电流为零,关闭电泳仪切断电源或自然风干。
图 1-2-9 醋酸纤维素薄膜装置示意图
4、染色与漂洗
用钝头镊子取出电泳后的薄膜,无光泽面向上,放在含有0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中,浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料,然后放到盛有漂洗液的培养皿中,每隔10min换漂洗液一次,连续数次,直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上,用电吹风的冷风将薄膜吹干。
5、透明
将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出后立即紧贴于干净玻璃板上,两者间不能有气泡。约2min—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次垂直放置待其自然干燥,或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗,当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角,用手轻轻将透明的薄膜取下,用滤纸吸干所有的水分,最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min,再用滤纸吸干液体石蜡,压平。此薄膜透明,区带着色清晰,可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。