紫外吸收法测定蛋白质含量

（一）原 理
蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。
（二）试剂及器材
（1）标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
（2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。
（三）操作
1. 280nm的光吸收法
（1）标准曲线的绘制：取8支试管，编号后按下表加入试剂。

管号 试剂(ml)	1	2	3	4	5	6	7	8
标准蛋白质溶液	0	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	4.0
蒸馏水	4	3.5	3.0	2.5	2.0	1.5	1.0	0
蛋白质浓度（mg/ml）	0	0.125	0.25	0.375	0.50	0.625	0.75	1.0
OD280

混匀 ，选用光程为1cm的石英比色杯，在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度（OD280）。以纵坐标为光密度值，横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。
（2）样品测定：取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
2．280nm和260nm的吸收差法 将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2~2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。
公式： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 OD280—0.74 OD260