蛋白质浓度测定 Folin-Phenol (Lowry)测定法

目的要求
(1)学习Folin-phenol法测定蛋白质含量的原理及方法。
(2)制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
原理
目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定得知;另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脉反应、Folin-phenol试剂法(又名Lowry method)。Folin-phenol法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法(Biuret method)灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素千扰。在测试时应排除千扰因素或做空白试验消除。

Folin-phenol试剂可由A试剂与B试剂组成。A试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肢键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。B试剂是由磷铝酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪胺酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪胺酸与色胺酸含量。
本法可测定范围是25-250 μg蛋白质。
试剂和器材
一、试剂
1．标准蛋白质溶液
结晶牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)配制成标准液150 μg/ml 蛋白质溶液。
2．Folin-phenol试剂
二、测试样品

三、器材
试管及试管架，0．5，1及5m1吸量管，恒温水浴，分光亮度计
操作方法

 

一、制作Folin-phenol法标准曲线

取7支试管，依下表操作。

绘制标准曲线:以A₆₅₀值为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

 

	1	2	3	4	5	6	7
标准蛋白质溶液/ml	0	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
蒸馏水/ml	1.0	0.9	0.8	0.6	0.4	0.2	0
Folin-phenol试剂/ml	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
混匀，于20-25 °C放置10 min，以蒸馏水为空白，在650 nm处比色
A650

 

本实验选用波长650 nm。请用Microsoft Excel 程序做图及计算标准曲线如下图(例):

二、测定未知样品蛋白质浓度测定

 

	空白管´2	样品管´2
未知浓度BSA溶液/ml	0	0.2
蒸馏水/ml	1.0	0.8
Folin-phenol试剂/ml	5.0	5.0
混匀，于20-25 °C放置10 min，在650 nm处比色
A650

 

参考文献