蛋白质含量的测定—Folin-酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝法（B

1.学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

2. 进一步掌握分光光度法——求标准曲线、准确测定未知样品、正确使用仪器。

 

原理

 

蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法是一般实验室中经常使用的方法。它们操纵简便、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般的浓度测定较为适应。Folin-酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。本实验采用的是Folin-酚法。

Folin-酚法所用的试剂由两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸，故有此颜色反应。因此，用Folin-酚法测定蛋白质含量灵敏度较高。

实验步骤

 

1. 标准曲线的制作：按下表操作

 

管 号	BSA   （300μg／mL）	H2O	Pr.含量   μg	步 骤
1   2   3   4   5   6	0   0.2   0.4   0.6   0.8   1.0	1.0   0.8   0.6   0.4   0.2   0	0   50   100   150   200   250	各 试管加入试剂甲5.0mL，混合后放置10分钟，加入试剂乙0.5mL，立即混合，37度恒温反应20分钟。以1号为参比，测A750的值。

 

2. 样品（小白菜）液的提取

称取小白菜1-4克（菜杆2-4克，菜叶1-2克）置于研钵中，加 5mL蒸馏水在低温下研磨成匀浆，全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度，然后抽滤，在3000rpm离心20分钟，上层清液为提取液，待用。

<!--[if !supportLists]-->3. <!--[endif]-->样品的测定

吸取提取液和稀释250倍的血清液各1.0mL于试管中（三次重复），分别加5.0mL试剂甲，放置10分钟后，加试剂乙0.5mL，立即混匀，恒温37度反应20分钟，测A₇₅₀的值。

 

 

管 号	小 白 菜   T 或 A	管 号	血 清   T 或 A
1   2   3		1   2   3

 

 

☆ 小白菜用mg／g， 血清用mg／mL。

 

二 考马斯亮蓝法（1976年）

 

原理

 

染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后引起染料最大吸收波长的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加，蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）

实验步骤

 

1.求标准曲线方程：按下表配置，操作。

 

 

管号	BSA   （150μg／mL）	H2O   （mL）	考马斯亮蓝   G-250（mL）	Pr.含量 操 作
1   2   3   4   5   6	0   0.1   0.2   0.4   0.8   1.0	1.0   0.9   0.8   0.6   0.2   0	5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0	0 室   10 温   20 放   40 置   80 五   100 min

 

 

2. 样品pr.含量的测定

吸取小白菜提取液0.5mL，加入 蒸馏水0.5mL（三次重复）；吸取血清（稀释500倍）1.0mL（三次重复），向以上各管加入考马斯亮蓝G-250 5.0mL，室温放置5分钟，测A₅₉₅的值（一小时内完成）。

 

 

管 号	小 白 菜   T 或 A	管 号	血 清   T 或 A
1   2   3		1   2   3

 

 

☆ 小白菜用mg／g，血清用mg／mL。

 

要求r≥0.99