蛋白质含量的定量测定——双缩脲法（Biuret法）

实验原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
试剂和器材
一、试剂

双缩脲试剂：取1.5g硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0g的酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 · 4H2O）溶于500mL蒸馏水中，在搅拌下加入300mL 10%NaOH溶液，用水稀释至1000mL。此试剂可长期保存、备用。

二、标准和待测蛋白质溶液
标准蛋白溶液

10mg/mL结晶牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。
待测蛋白质溶液

人血清（稀释10倍）。测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。

三、器材
试管1.5×15cm（×16），试管架，移液管1mL（×3）；5mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。
操作方法

一、制作标准曲线

取12支试管分成两组，按下表平行操作：

蒸馏

	0	1	2	3	4	5
标准蛋白液(mL)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
蛋白浓度(mg/mL)	0	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0
水(mL)	1.0	0.8	0.6	0.4	0.2	0.0
双缩脲试剂(mL)	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30min
A540

 

取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

二、样品测定

取4支试管分成两组，按下表平行操作：

 

	0	1
血清稀释液 (mL)	0	0.5
蒸馏水 (mL)	1.0	0.5
双缩脲试剂 (mL)	4.0	4.0
充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30min
A540

 

三、计算

取两组测定的平均值计算：

血清样品蛋白质含量（mg/100mL）=

 

其中,Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/mL），N为稀释倍数，V为血清样品所取的体积（mL），c为样品原浓度（mg/mL）。

注意事项

（1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。