蛋白质的定量测定——紫外（UV）吸收测定法

实验原理

蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中核酸等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。该法可测定蛋白范围应在0.1~1.0mg /mL。

试剂和器材

一、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL蛋白溶液。

2. 待测蛋白质溶液

人血清，使用前稀释100倍。

二、器材

试管1.5×15cm（×9），试管架，移液管1mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取8支试管编号，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英 比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

二、样品测定

取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

注意事项

由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。

 

	1	2	3	4	5	6	7	8
标准蛋白质溶液（mL）	0	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	4.0
蒸馏水（mL）	4.0	3.5	3.0	2.5	2.0	1.5	1.0	0
蛋白质浓度 (mg/mL)	0	0.125	0.250	0.375	0.500	0.625	0.750	1.00
A280