植物体内可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法)

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

【原理】

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。



【试剂】

（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；

（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；

（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。

【方法】

1.标准曲线的绘制

（1）0～100μg/ml标准曲线的制作取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

表28-1配制0～100μg/ml血清白蛋白液

 

 

管号	1	2	3	4	5	6
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg)	0 1.0 0	0.2 0.8 0.02	0.4 0.6 0.04	0.6 0.4 0.06	0.8 0.2 0.08	1.0 0 0.10

 

 

（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。

表28-2配制0～1000μg/ml血清蛋白血液

 

 

管号	7	8	9	10	11	12
1000μg/ml牛血清白蛋白（ml）   蒸馏水量(ml)   蛋白质含量(mg)	0 1.0 0	0.2 0.8 0.2	0.4 0.6 0.4	0.6 0.4 0.6	0.8 0.2 0.8	1.0 0 1.0

 

 

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

3.结果计算

样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=

式中C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（ml）；

a－测定所取提取液体积（ml）；

W－取样量（g）。