血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

原 理

以醋酸纤维薄膜为支撑物，浸入pH8.6的缓冲液后吸去多余液体。将微量血清点于膜上，电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，洗去多余染料。

操 作

1．准备与点样

(1)将薄膜切成2.5×8cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2cm处用铅笔划一线，以标明点样位置。同时在一端边沿写上实验者的学号或姓名。

(2)将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上(缓冲液盛于培养皿中)，使膜条自然浸湿下沉；

(3)将充分浸透(膜上没有白色斑痕)的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上使点样线架空。

(4)用血色素吸管吸取新鲜血清3~5ul，涂于载玻片末端处，或用载玻片在血清上蘸一下，使载玻片下端粘上一薄层血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部透入膜内，移开载玻片。

2．电泳

将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后通电，电压为110V，电流为0.4~0.6mA/cm，通电1小时左右关闭电源。

3．染色

通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。

4．定量

本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。

5．计算

光密度总和T=A+α1+α2+β+γ

各部分蛋白质的百分数为：

临床意义

1．正常值： 白蛋白57~72%α1球蛋白2~5%α2球蛋白4~9%

β球蛋白6.5~12%γ球蛋白12~20%

2．肝硬化时白蛋白显著降低，γ球蛋白升高2~3倍；肾病综合症时白蛋白降低，α2和β球蛋白升高。

试剂与器材

1．电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽用有机玻璃或塑料等制成。它有两个电极，用白金丝制成。

2．巴比妥缓冲液，pH8.6，离子强度0.06

巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g于蒸馏水中加热溶解后再加水至1000ml?

3．氨基黑10B染色液

氨基黑10B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml

4．漂洗液配法

95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml 混匀。

注意事项

1．醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白的正常结果不同于纸上电泳，主要是白蛋白偏高，个别正常人白蛋白仅超过70%。α1，α2，和β，γ都偏低，个别正常人γ球蛋白可低到12%左右。上述正常值仅供参考。

2．经电泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95%乙醇(2∶8)溶液中20分钟，取出后将薄膜平贴于玻璃板上。干燥过程中，薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计绘出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数。目前国内已有自动定量的光密度计生产。此透明薄膜可长期保存，供教学示教用。

附：迁移率是胶体颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质等物质以及研究它们的某些理化性质。现将人血浆蛋白质的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。

人血浆蛋白质的等电及迁移率

 

蛋白质名称	等电点	泳动度/(cm2·V-1·S-1)	分子量
清蛋白	4.88	-5.9×10-5	69000
α1-球蛋白	5.06	–5.1×10-5	200000
α2-球蛋白	5.06	–4.1×10-5	300000
β-球蛋白	5.12	-2.8×10-5	9000-150000
γ-球蛋白	6.85-7.50	-1.0×10-5	156000-300000
纤维蛋白元	5.40	–2.1×10-5