琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)

琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由D-半乳糖和3、6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖，含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。

琼脂糖电泳具有以下优点：①琼脂糖含液体量大，可达98％～99％，近似自由电泳，但样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微；⑦琼脂糖作为支持体有分辨率高、重复性好等优点；③电泳速度快；④透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定；⑤区带可染色，样品易回收，有利于制备。缺点是琼脂糖中有较多硫酸根，电渗作用大。

琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定、DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用方法之一。

琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。

一、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

1．DNA分子的大小：在凝胶中，较小的DNA片段迁移比较大的片段快。DNA片段迁移距离（迁移率）与其分子量的对数成反比，见图4-7。因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。

2．琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同（图3-3）。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围详见表3-1。因而要有效地分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。

二、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA的移动速度次序如下：共价闭环DNA（简称cccDNA）＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。

三、琼脂糖凝胶电泳基本方法简介

1．凝胶电泳类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳也可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1~2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。

表3-1琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系

 

琼脂糖凝胶浓度/（%）	可分辨的线性DNA大小范围/（kb）
0.3	60~5
0.6	20~1
0.7	10~0.8
0.9	7~0.5
1.2	6~0.4
1.5	4~0.2
2.0	3~0.1

2．缓冲液系统DNA的电泳迁移率受到电泳缓冲液的成分和离子强度的影响，当缺少离子时，电流传导很少，DNA迁移非常慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流传导非常有效，导致大量热量产生，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。

常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约50mmol/L（pH7.5~7.8），详细配制见表3-2。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。

表3-2常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液

 

缓 冲 液	工 作 溶 液	贮 存 液（1000ml）
Tris-乙酸   （TAE）	1×∶ 0.04mol/L Tris-乙酸   0.001mol/L EDTA	50×∶242g Tris   57.1ml冰乙酸   100ml0.5mol/L EDTA（pH8.0）
Tris-磷酸   （TPE）	1×∶ 0.09mol/L Tris-磷酸   0.002mol/L EDTA	10×∶108g Tris   15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）   40ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
Tris-硼酸   （TBE）	0.5×∶0.045mol/L Tris-硼酸0.001mol/LEDTA	5×∶54g Tris   27.5g 硼酸   20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）

3．琼脂糖凝胶的制备

水平型：以稀释的工作电泳缓冲液配制所需的凝胶浓度。

4．样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料与10~15%蔗糖或10~15%甘油，以增加其比重，使样品集中。

5．电泳琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，分子量高的DNA片段迁移率的增加是有差别的。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，分子量与迁移率之间就可能偏离线性关系。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。

6．染色常用荧光染料溴乙锭（EB）进行染色以观察琼脂糖凝胶内的DNA条带。