酶切片断的脱磷技术

在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除5'磷酸基团，而DNA的脱5'磷酸基团是基因重组、载体构建中防止载体DNA自身联接、环化的重要途径，载体经单酶切线性化后,3’端为羟基、5’端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发生载体自连,而5’脱磷后,载体在5’与3’位均为羟基不能自连只有与带5’磷酸基的外源片断连接,载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口,缺口在转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在RNA、DNA、三磷酸腺苷、脱氧三磷酸腺苷的5’端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。

一：仪器;
离心机恒温设备真空干燥机 取液器

二：试剂;
碱性磷酸酶、λDNA酶切片段、酚、氯仿、0.5M EDTA(pH 8.0) 、SDS、 TE缓冲液、电泳缓冲液、7.5M NH4AC(pH 7.5)

１０×碱性磷酸酶缓冲液：10mM;ZnCL

10mM;MgCL

100mM;Tris-HCL(pH 9.0)

三：操作

１：在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入

10×碱性磷酸酶缓冲液10μl

碱性磷酸酶(0.01u/pmol ends) 1-2ul

ddH2O到 100ul

对于5’突出则37℃下温浴30分钟,再加入1ulCIAP(0.01u/pmol ends), 37℃下温浴30分钟.

对于平末端或3’突出末端,则37℃下温浴15分钟,56℃下温浴15分钟, 再加入1ul CIAP(0.01u/pmol ends), 37℃下温浴15分钟. 56℃下温浴15分钟

２：温浴结束后加入EDTA(pH 8.0)至终浓度分别为10mM，65℃加热20min，以灭活碱性磷酸酶

３：用酚、氯仿各抽提一次

４：加入1/2体积NH4AC，充分混匀，再加入２体积的乙醇，－20℃放置2hr（或－70℃30分钟），12000g离心10分钟，沉淀DNA。

５：冷70%乙醇洗沉淀一次

６：TE溶解（终浓度为100μg/μl），-20℃保存

四:检测

将脱磷片断中加入连接酶,以加入连接酶的非脱磷片断作为对照,,连接反应后,Agarose电泳分析,脱磷片断不能连接,而非脱磷对照片断能连.

注：1, pmol ends=3.04×ugDNA/DNA的碱基数

2，在上述几个实验中，有机溶剂沉淀时所用NaAC的pH最好为7.2或用7.5M的NH4AC，如用pH5.2的溶液则有可能导致EDTA沉淀量增加，影响以后的连接反应。

3,碱性磷酸酶有两类BAP（细菌碱性磷酸酶）和CIP（小牛肠道碱性磷酸酶），因BAP耐热，灭活时必须采用有机溶剂抽提法，而CIP在68℃10％SDS条件下级可灭活，因此实验中一般都采用CIP。