基因组DNA文库构建必备实验技巧-1

基因组DNA文库用途十分广泛，如用于人类及动植物基因组学研究，基因表达调控研究，分析、分离特定的基因片段等。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为四大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA） 毫无疑问，高质量的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。需要通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离 过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA
根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体，合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体，合适的片段长度平均为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：
（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
（2）电泳以后，应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间，否则会显著降低克隆效率。
（3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。
三、载体的选择
目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。选用何种载体可以参考如下几个因素：
1、目标区域的大小：
如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，可以方便的构建黏粒载体文库。
如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒。
如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难。
表1 各种载体的比较

载体

容量（kb）

宿主

导入细胞方式

 

黏粒

30-45

大肠杆菌

转导

 

P1

70-100

大肠杆菌

转导

 

PAC

130-150

大肠杆菌

电转

 

BAC

120-300

大肠杆菌

电转

 

YAC

250-400

酵母

转化

2、筛选文库的难易程度：
黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。
3、 载体拷贝数的考虑：
当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统，CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。
四、将基因组DNA片段连接入载体
使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。许多商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。选用连接快、效率高的连接酶，连接反应体系以100μl为宜。
注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。
五、将重组载体转入宿主细胞
如果构建黏粒文库，需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染。挑出重组子，鉴定插入片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话, 就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。
如果构建BAC文库，应选择电转法，将上述连接产物转入受体菌，涂板长出克隆。获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。如果文库大小合适，就可以进行后续操作了。
六、文库克隆数的确定
基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：
N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。
举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = 138,298