DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-3

当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无α互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色，见图7-11 。
如果外源DNA插入片段相当短，不破坏β-半乳糖苷酶的氨基端氨基酸序列的阅读框，有时产生的重组体菌落不呈白色而是呈浅蓝色。
4.根据插入的外源性DNA片段的性状进行筛选
如果外源性DNA片段可编码产生蛋白质，并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该蛋白质的性状进行筛选。如亮氨酸是细菌生命活动所必需的，当外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因时，将该外源性DNA片段转入亮氨酸缺陷的细菌中，放入仅含亮氨酸的培养基中，只有能利用亮氨酸的细菌才能生长，因此，能生长的细菌即为含有外源性DNA片段。
（二）根据重组DNA的结构特征进行筛选
1.重组DNA的快速裂解、鉴定
是重组DNA的初步筛选方法，根据重组DNA大小和载体DNA大小之间的差别来区分的。当重组DNA克隆在培养基平板上长到2mm左右时，挑取菌落，加入50μl裂解液（50mmol/LTris-HCl,pH6.8;1%SDS;
2mmol/L EDTA;400mmol/L蔗糖;0.01%溴酚蓝）进行裂解，37℃下保温15分钟后，以12000r/min离心（4℃），吸上清，在1%琼脂糖胶中进行电泳分离，紫外灯下观察并比较与载体DNA片段迁移率，初步判断是否有外源DNA插入。

2.限制性内切酶图谱进行分析
当初步确定是带有外源性DNA片段的重组体菌落时，则挑少量菌落进行小量培养。然后进行快速抽提得到重组DNA，用限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳分析是否有外源DNA的插入。
3.核酸分子杂交方法进行鉴定
核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNA的最通用方法
常用核酸分子杂交方法及实用范围


4、PCR扩增方法进行鉴定
根据已知插入的外源性DNA片段的序列，设计出相应的引物；也可根据一些载体克隆位点两翼存在恒定的序列，如pGEM载体系列中双侧是SP6及T7启动子的序列，通过与SP6、T7启动子互补的通用引物对，直接用PCR对小量抽提得到重组DNA为模板，进行扩增，通过PCR产物的电泳分析可以确定是否有目的DNA的插入。利用PCR的方法除了迅速扩增特异的外源性DNA片段，还可以利用其产物进行DNA序列的直接测序。该方法目前已得到广泛的应用。
5、DNA序列分析鉴定
DNA序列分析是最后确定分离的DNA是否是特异的外源性插入DNA的唯一方法，也是最确定的方法。现在DNA序列分析已实现自动化，是一个快速、简便和实用的方法。
综上介绍的几种基因重组体筛选及最后如何确证所克隆基因序列正确性的方法。在应用时要根据具体情况选择适当的方法，本着先粗后精的原则，对重组体进行逐步的分析。