基因工程的载体和工具酶-5

（二）Klenow片段酶

Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。

酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性

　　　　　⑵3’→5’ 的核酸外切酶活性

Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：

⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端

⑵标记DNA片段的末端

底物用［α－32P］－dNTPs

⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成

⑷DNA序列的测定

（三）T4 DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，

1.酶催活性：

⑴5′→3′的聚合酶活性

⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强100～1,000倍。

因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：

如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。

2.T4DNA聚合酶的用途

(1)利用取代合成反应制备探针

(2)标记具有平末端的或具有3’－隐蔽末端的DNA片段

利用较强的3 ′→ 5 ′外切酶活性和 5′→3′聚合活性

(3)用于DNA序列分析

（四）逆转录酶（反转录酶）

逆转录酶 是一种依赖RNA的DNA聚合酶。

此酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。
最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）分离出来的。

活性：一种可以有效地将mRNA反转录成DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).

主要用途是将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。

四、修饰性工具酶

（一）末端转移酶（terminal transferase）

末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。

特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。

最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。

（二） SI核酸酶（SI nuclease）

这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离的高度单链特异的外切酶。

活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。

其主要用途有：

⑴　在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端；

⑵　载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，

形成平末端结构。

（三）碱性磷酸酶

从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphatase）简称BAP。

从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（ Calf Intestinal Alkaline Phosphatase） ，简称CIP，用的广泛。

酶催功能：

脱磷酸作用，将单链或双链DNA或RNA5’－P转化成5’－OH。

其主要用途有：

⑴在用32P标记DNA 5′端之前，去除5′端的磷；

⑵在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。