目的基因片段与载体连接

1．目的

学会DNA片段的体外连接技术。

2．原理

在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。

易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

4．试剂

pUCm-T 载体，Pinpoint™xa-3酶切载体，CHI插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddH2O。

5．实验准备

1.5ml离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基（含Amp）。

6．操作步骤

1）PCR产物与pUCm-T载体直接连接：

（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16°C。

（2） 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入：

4μl PCR 产物混合液

1μl pUCm-T载体

0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）

1μl 连接酶缓冲液

3.5μl ddH2O

总量 10μl 体系

（3） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C水中保温过夜。

（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。

2）DNA回收片断（CHI）与载体（Pinpoint™xa-3）连接：

（1） 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入

4μl 回收DNA片断

1μl 酶切后回收的载体

0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）

1μl 连接酶缓冲液

3.5μl ddH2O

总量 10μl 体系

（2） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C干式恒温仪（或16°C水中）中保温过夜。

（3） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用