重组表达载体pET-32a-His-APC10的序列测定

通过上述实验所构建的表达质粒pET-32a-His-APC10经限制性内切酶分析正确后，必须进行DNA序列测定，以获得序列完全正确的克隆。

1. 基本原理
目前应用的DNA序列测定方法有双脱氧法（Sanger法）和化学测序法（Maxam-Gilbert法），在变性聚丙稀酰胺凝胶（测序胶）上进行高分离度的电泳过程是传统DNA序列测定的工作基础。本实验采用新的毛细管电泳法，根据双脱氧法测序的原理，进行热循环测序。测序反应中，测序酶FS以待测DNA为模板，在引物的启动下，按5'到3'方向合成与模板互补的新生DNA链；同时，将某一特定的荧光标记的双脱氧核糖核酸( ddNTP )随机掺入在新生链中，使合成反应被选择性终止在A、C、G、T处，形成长短不一的末端有荧光标记的DNA链。由于四种双脱氧核糖核酸末端标记有不同的荧光颜料，在激光激发下，不同荧光标记的ddNTP具有不同的荧光波长，因此，每个样品只需作一个反应。用热循环法进行DNA测序反应，少量的模板被重复用于生产DNA序列梯度，双脱氧测序反应混合物反复进行类似PCR反应的变性、退火和延伸的步骤，测序产物以线性增长。反应产物经纯化、变性后，上样到预装有POP-6多聚体的毛细管中。样品注射液中含有甲酰胺，能破坏DNA的二级结构，在电场作用下，单链DNA因分子量大小不同而出现泳动速度的差异，分辨率可达一个碱基。当长短不同的DNA链依次通过荧光界面时，该界面的激光光束可激发其末端的荧光物质，使其发射荧光。荧光信号被CCD照相机接收并转换为电信号，测序软件对其进行分析、转换并储存为序列图谱。

2. 材料
1）待测DNA模板，即pET-32a-His-APC10。
2）Applied Biosystems生产的ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits，内含不同荧光颜料标记的ddNTP mix、dNTP mix、耐热DNA聚合酶FS、MgCl2、pH9.0的Tris-HCl缓冲液等测序所需试剂。
3）乙醇，醋酸钠，样品注射液Hi-Di Formamide。

3. 仪器
1) Applied Biosystems生产的全自动毛细管测序仪ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer。
2) Applied Biosystems生产的全自动PCR仪GeneAmp PCR System 9700。
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

4. 方法
1) 测序反应：
PCR总反应体积为10μl，组成如下：
DNA 250ng
Primer 3.2pmol/μl 1μl
BigDye mix 4μl
H2O x μl
PCR反应条件如下：
98°C 2min
96°C 20 sec, 50°C 20 sec, 60°C 4min, 25 cycles
反应产物纯化：本实验利用乙醇沉淀法纯化延伸产物，方法如下：
沉淀反应物，将以下各组分混匀，-70°C，静置10 min；
PCR反应液 10μl
水 10μl
3M NaAc 2μl
乙醇(100%) 50μl
离心，13，000rpm，20min，4°C，弃上清；
洗涤，加200μl 90%乙醇，离心，13，000rpm，20min，4°C，弃上清；
重复上述过程一次；
干燥 ，加30μl Hi-Di Formamide，重悬延伸产物；
95°C，变性5分钟
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
2) 毛细管电泳：
将溶解后的反应产物转至96孔板中，自动上样器上样，电泳。
3) 数据采集与处理：
CCD照相机接收荧光信号并将其转换为电信号，测序软件分析、处理并储存数据。

5. 特点
1) 模板范围宽，不必将目的基因克隆到特定载体中，可对单链、双链DNA模板、PCR产物及BAC等进行测序。
2) 单链和双链模板的操作程序相同。
3) 双链模板不需预先进行碱变性。
4) 需要的模板量很少。
5) 测序反应需要的人工操作较少，不需要制聚丙稀酰胺凝胶，不需要人工上样，自动化程度高。
6) 16个样品同时检测，测序的敏感性高。
7) 可快速分离样品，电泳仅需要两小时。
8) 结果重复性好。

6. 技术要点
1) 模板制备：模板纯度要求较高，不能有蛋白质、盐、去垢剂及RNA的残留。
2) 对于GC比例较高的模板（>70%），在反应前，先在98°C加热5分钟，使模板充分变性。
3) 如果引物的Tm值>60°C ，退火反应可省略；如果引物的Tm<50°C，退火反应时间应延长至30秒钟或将退火温度降低至48°C。
4) 模板量要适中，具体用量可参照以下标准：
PCR产物： 100-200bp 1-3 ng
200-500bp 3-10 ng
500-1000bp 5-20 ng
1000-2000bp 10-40 ng
>2000bp 40-100 ng
单链模板：50-100 ng
双链模板：200-500 ng
如果待测PCR产物小于30 bp，反应可少于20个循环。
5）反应产物必需纯化，彻底去除未掺入的荧光标记的双脱氧核糖核酸，纯化方法可采用柱纯化法或沉淀法。
6）用其它型号的PCR仪时，应优化PCR反应条件。