基因的翻译表达(2)

1：重组载体构建同前面实验

2：诱导表达：提取带重组片断的质粒DNA转化BL21（DE3）受体菌37℃活化过夜，转入新鲜培养基摇菌至对数生长期（约2－3小时），加入IPTG至终浓度0.4mM，继续培养6小时

3：表达产物提取及鉴定见实验十九

二：融合表达

仪器：同上

材料及试剂：载体PinPointX(图17-2),菌株JM109，诱导剂IPTG及PinPoint纯化试剂盒所带试剂。

图17-2PinPointXa载体结构图

方法

1：重组载体构建同前面实验

2：诱导表达：提取带重组片断的质粒DNA转化JM109受体菌37℃活化过夜，转入新鲜培养基(含2mMbiotin)摇菌至对数生长期（约2－3小时），加入IPTG至终浓度0.1mM，继续培养4-5小时

3：表达产物提取及分析按图17-3进行.

其原理为Softlink树脂上结合有生物素亲和基团,该基团能与融合蛋白中来自于载体的前导肽亲和结合,因此利用亲和层析原理可特异性提取纯化融合蛋白.由于来自以载体的前导肽的C末端有专一性的Xa蛋白酶的作用位点,因此纯化后的融合蛋白用Xa蛋白酶切割,即可释放出外源基因蛋白

具体为

A:细胞裂解(冰浴操作)

a:离心沉淀细胞,沉淀悬浮于10倍体积(ml/g细胞沉淀)的细胞裂解液(50Mm Tris-HCl,pH7.5,50mMNaCl,5%甘油)

b:加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml,冰浴搅拌20min

c:加入DOC(脱氧胆酸钠盐)到终浓度0.1%,冰浴搅拌5min

d:加入200UDNase以降低黏度

e:10000g,15min离心取上清

B:上柱

a:装柱,用含5mM生物素的平衡液(50mMTris-HCl,pH8.0,含50-200mMNaCl,4Mmdtt,2Mmedta,10%甘油或0.1%TritonX-100)(2倍柱体积)浸泡柱材(Softlink树脂),取1ml装入专用层析管中

b:平衡柱,用8柱床体积的10%乙酸洗柱,再用8柱床体积的100mMpH7.0磷酸盐(磷酸钠)缓冲液洗柱(要求流出液pH达到6.8)

c: 用1体积平衡液平衡柱

d:将细胞裂解后的上清液浓缩后溶于平衡液中,上样

C:洗脱

a:洗柱,上样后用5柱床体积的平衡液洗柱,以洗脱未结合到柱上的杂蛋白

b:洗脱蛋白,用含5mM生物素的平衡液洗脱,直至蛋白峰出现.