HCG金标免疫试验方法及注意事项

1．金标免疫试验的原理将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金)标记抗体，(或金黄色葡萄球菌A蛋白SPA)。金标为一种催化剂，经还原剂(如对苯二酸)处理，将显影剂中的银离子还原成不溶性金属银，沉淀在每个金颗粒的周围，银沉淀在光镜下可清楚地显示。滴金免疫实验原理同一般免疫斑点实验，也是用已知抗原或抗体包被硝酸纤维素膜，再用金标记抗体或抗原进行快速测定。临床应用的有两种方法：金标一步法(层析法)和金标二步法(斑点渗漏法)。具体讲即用两个人HCG—β单克隆抗体，一个抗体吸附于硝酸纤维素薄膜(NC膜)上，另一抗体结合于金溶胶颗粒表面。尿中HCG先与NC膜上的抗体-结合，然后再与金标单抗溶液反应，形成抗体一HCG一金标抗体的加心式复合物．红色的金斑点．

胶体金溶液的制备是依所需胶体金颗粒的直径配制A液及B 液，见表4—7。预热至60℃并保持此温度，磁力棒搅拌混合A液及B液，加热至沸，溶液由蓝紫变成橙红色，表明胶体金颗粒形成。冷后补加重蒸馏水至100ml。免疫金银染色法用5mm直径胶体金，滴金免疫技术用15mm胶体金。

2．金标免疫试验的方法

(1)金标二步法(斑点渗漏法)：中心圆点为一株单抗(金一Ab—Abl一薄膜的红色斑点)，边上小点为抗鼠二抗(金一Ab—Ab2一薄膜的质控点)。

试剂盒包括：渗滤盒和金标记抗HCG一β亚单位单抗体。渗滤盒为30mm长，6mm厚的正方形塑料盒，中央有8mm直径的圆孔。盒内紧塞多层吸水填料，填料上为孔径0．45nm的硝酸纤维素薄膜，膜上包被有抗HCG的抗体。

操作方法为先用小吸管向检测盒圆孔中央滴3滴待检尿液。待渗入；然后加金标记抗HCG—β亚单位单抗液(A试剂)两滴，待渗入后取出滤器；最后加B试剂(PBS)两滴，待干。

结果判断：阳性为小孔中央出现红色斑点，质控点呈蓝色，提示含有HCG。阴性为小孔中央无红色斑点，仅质控点呈蓝色，提示不含HCG。如失败则小孔中央及质控点均不呈显颜色，提示试剂失效，或操作失当。

注意事项：①血清标本应尽可能新鲜，溶血，反复冻融，高血脂等均可影响结果。②胶体金颗粒>10mm的金粒子不易穿透组，作细胞内抗原定位时，应配制直径5mm的金溶胶。③硝酸银、对阿苯二酚对光敏感，溶液应避光保存，或现配现用。④NC膜孔以0.45mm为宜。

(2)早早孕胶体金标试条：金标试条下端为吸附有金标单抗的玻璃纤维，中段为醋酸纤维薄膜，上方还有抗鼠二抗。试条下端浸入尿液时金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若有HCG抗原，即形成Ag—Ab一金复合物；再上行至中段醋酸纤维膜，即与其下面-的另一单抗结合，并被固定下来，显示阳性结果。其上方还印有一条抗鼠二抗，待游离的红色金标单抗上行到抗鼠二抗处被固定下来，做为金标质控的提示。

方法是将试条有标志线的下端浸入尿液标本中，深度不可超过标志线，约3秒后取出，平放，5分钟内观察结果：两条红线为(+)，提示尿中含HCG。一条红线为(一)，表示不含HCG。

(3)金标一步渗滤法：试剂盒组成：测定小盒20只，试剂A及试剂B各1瓶，塑料滴管20根。

测定步骤：①从冰箱取出的试剂盒须在室温下放1～2小时预温，将试剂A颠倒混匀；②加新鲜尿液6滴于测定盒小孔中，待尿液完全渗入膜下；③去除小孔上面的蓝色过滤器；④加试剂A2滴于小孔内，待红色溶液完全渗入膜下，即可观察结果：阳性为小孔的膜上呈红色圆点，色泽随尿中HCG浓度增加而加深，HCG含量为50IU／ml-100mIU／ml时呈淡红色斑点。阴性则无斑点出现。

注意事项：试剂盒保存温度不宜>20℃，A液应放在4～10℃冰箱内保存，有效期12个月。此外，每次吸取尿液必须用新的滴管。