免疫荧光组织（细胞）化学技术——荧光素及其标记抗体的方法 1

制备荧光抗体是免疫荧光组织化学的重要技术之一，制备特异性强和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高效价的抗体。
 
一、荧光素
 
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光素。目前主要常用于标记抗体的荧光素如下：
 
1、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）
 
FITC是一种呈黄色粉末状，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年，易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为389.4。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键结合，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。
 
2、四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TMRITC）
 
TMRITC是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与 FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究。
 
3、得克萨斯红（texas red)
 
得克萨斯红是一种褐色粉末状，易溶于有机溶剂，性质稳定，在4℃下能保存2年以上，最大吸收光谱为 590-595nm，最大发射光谱为620-630mm，共有四种结构，常用的分子量为625.15。
 
4． 其它荧光素
 
如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）、7-氨基甲基香豆素（AMC）呈蓝色荧光，藻红素R（phycoerythrin-R），花青（Cyanine、Cy2、Cy3、Cy5和Cy7）等。

二、荧光素标记抗体的方法
 
1、FITC标记抗体的方法
 
（1）Marsshall氏法
 
材料：抗体溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25-50ml) 、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2的0.01mol/L PBS葡聚糖凝胶G-25层析柱等。
 
方法及步骤：
 
①抗体的准备：取适量已知抗体浓度之溶液，加入三角烧瓶中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后抗体浓度为 20mg/ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置于冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5~10min。
 
②荧光素的准备：根据标记的抗体总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
 
③结合：边搅拌边将称取的荧光素渐渐加入抗体溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约在 5~10min内加完），加完后，在4℃左右继续搅拌12~18h，通常将装置安放4℃冰箱或冰库中进行。
 
④透析：结合完毕后，将标记的抗体溶液离心（2000r/min）10min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中再置于烧杯中用0.01M pH7.2缓冲盐水透析（0~4 ℃）过夜。
 
⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。