中和反应(neutrallzation reaction)技术

病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之中和试验。本试验主要用于：（1）从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病；（2）用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型；（3）测定抗病毒血清或抗毒素效价；（4）新分离病毒的鉴定和分型，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。
 
1、简单定性中和试验
 
本法主要用于检出病料中的病毒，亦可进行初步鉴定或定型。先根据病毒易感性选定试验动物（或鸡胚、细胞培养）及接种途径。将病料研磨，并稀释成一定浓度（约100 LD50～1000LD50或TCID50）。污染的病料需加抗生素（青霉素、链霉素各200～1000单位），或用细菌滤器过滤，与已知的抗血清（适当稀释或不稀释）等量混合，并用正常血清加稀释病料作对照。混合后置 37℃1h，分别接种实验动物，每组至少3只。分别隔离饲喂，观察发病和死亡情况。对照动物死亡，而中和组动物不死，即证实该病料中含有与该抗血清相应的病毒。本法亦可用于毒素（如肉毒毒素）的鉴定和分型。
 
2、固定血清稀释病毒法
 
本法多将病毒作10倍递增稀释，分置2列试管，第一列加正常血清（对照组），第二列加待检血清（试验组）。混合后，置37℃作用1h，将各管混合液分别接种选定的试验动物，每一稀释度用3～5只动物。接种后，逐日观察，并记录其死亡数，观察结束后，计算LD50和中和指数（表 1、表2），本法适用于大量检样的检测。

 

表1 固定血清稀释病毒法术式

混合前病毒稀释					2×10-1	2×10-2	2×10-3	2×10-4	2×10-5	2×10-6	2×10-7	——
正常血清				稀释病毒	——	——	——	1.0	1.0	1.0	1.0	——
				正常血清	——	——	——	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
对照组				稀释液	——	——	——	——	——	——	——	1.0
待测血清				稀释病毒	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	——
				待检血清	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
中和组				稀释液	——	——	——	——	——	——	——	1.0
混合后病毒稀释					10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	——

 

 

 

表2 固定血清稀释病毒法中和试验（例一）

病毒稀释	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	LD50（2）	中和指数
正常血清对照组	——	——	——	4/4（1）	3/4	1/4	0/4	10-5.5	103.3＝1.995
待检血清中和组	4/4	2/4	1/4	0/4	0/4	0/4	0/4	10-2.2
注：（1）分母为接种数，分子为死亡数；（2）LD50计算见实例。

 

中和指数＝中和组LD₅₀/对照组LD₅₀=10^-2.2/10^-5.5=10^3.3，查3.3反对数是1.995，故中和指数10^3.3＝1.995。也就是说该待检血清中和病毒的能力为正常血清的1.995倍。本法多用以检出待检血清中的中和抗体，对病毒而言，通常中和指数大于50者判为阳性，10～49为可疑，小于 10为阴性。

3、固定病毒稀释血清法

 

本法用以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液（与血清混合后，每一接种剂量含病毒100LD₅₀），摇匀后，置37℃作用1h，接种实验动物（表3）。

 

表3 固定病毒稀释血清中和试验（例二）^（1）

血清稀释度（2）价（PD50）（4）	1：100	1：20	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	1：1280	1：2560	——	血清中和
正常血清	0/4（3）	——	——	——	——	——	——	——	——	——	——
康复血清 1：141	4/4	4/4	4/4	3/4	2/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4
免疫血清 1：1280	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	2/4	0/4	0/4
注：（1） 接种剂量0.1ml，含病毒100LD50；（2）系指与病毒混合后的稀释度；（3）分母为接种数，分子为保护数；（4）PD50为半数保护，其计算法同LD50的计算。

 

4、空斑减少法

在细胞培养上进行病毒中和试验，近年来多采用空斑减少法。先将病毒稀释成适当浓度，使每0.2ml含80个～100个PFU（空斑形成单位），与不同稀释度的待检血清等量混合，置37℃作用1h～2h，分别测定PFU，使空斑减少50%血清稀释度即为该血清的中和价。见表4。

 

表4 空斑减少法中和试验示例

血清稀释倍数（1）			1：16 （4-2）	1：64 （4-3）	1：256 （4-4）	1：1024 （4-5）	1：4096 （4-6）	不加血清对照	中和抗体价（2）
待检血清A		空斑数	3	13	38	51	53	55	4-3.6=1：140
		空斑减少率	95%	76%	31%	7%	0%
待检血清B		空斑数	——	8	52	51	56	55	4-4.1=1：290
		空斑减少率	——	85%	54%	7%	0%
待检血清C		空斑数	——	——	6	22	44	55	4-5.2=1：1300
		空斑减少率	——	——	89%	59%	19%
注：（1）血清用4倍递增稀释；（2）空斑减少50%的血清稀释度，其计算法同LD50的计算。