中和实验（Neutrlization test）

中和实验是一种特异性和敏感性均很高的血清学实验。在体外，病毒可以被相应的特异性抗体中和而失去其感染性，通过单层细胞培养检验病毒的感染性是否失去的方法称为中和实验。
 
中和实验是以测定病毒的感染性为基础，所以该实验必须在动物，鸡胚或组织培养细胞等活性体内进行，必须选用对病毒敏感的细胞，动物或鸡胚为材料，根据实验的不同目的设置严格的对照实验。
 
中和实验的主要应用是：
 
1 鉴定病毒：中和实验具有很高的特异性，利用已知型别的免疫血清与未知病毒做中和实验，如被中和，不但可以定量，而且可以定性。
 
2 可以用于分析病毒的抗原性。
 
3 测定免疫血清的效价和疫苗免疫后的抗体反应。
 
4 测定血清中的抗体滴度，用于诊断病毒性疾病。
 
[原理] 特异性的抗病毒免疫血清——中和抗体与病毒作用，能够抑制病毒对敏感细胞的吸附、穿入和脱壳，从而抑制了病毒的增殖，使 病毒失去感染性，中和实验常用有两种方法：一种是用已知病毒检测被测血清中的抗体效价，另一种是用已知免疫血清鉴定病毒型别。
 
一 ）中和实验方法一——用已知病毒检测被检血清中的抗体效价
 
1 材料

1 ）病毒悬液：选用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒液各 1.5ml 。使用前用 Eagle 维持液稀释至 100TCID50/0.1ml 含量（ TCID50 即能使 50% 组织培养管发生细胞病变的病毒量）
 
2 ）待检血清；用前 56 ℃ 30 分钟灭活，以除去非特异性抑制物
 
3 ）敏感细胞：需长成单层，一般需 2-4 天，根据细胞种类和繁殖程度确定，本实验选用 Hela 细胞培养管 40 只。
 
4 ）灭菌 Eagle 维持液、灭菌小试管 15 只、灭菌 1ml 吸管， 37 ℃水浴箱， 37 ℃ 5%CO 2 培养箱和显微镜。
 
2 方法

a 实验组实验方法（ 1-5 号管）
 
1) 稀释血清：取 15 支灭菌试管，分成三排，每排 5 只分别编号。将待检血清用 Eagle 维持液从 1 ： 5 按四倍递增稀释到 1:1280, 稀释后的血清每管 0.25Ml.
 
2) 在第一排各试管内，每管加入Ⅰ型病毒液 0.25ml ，第二排各试管内，每管加入Ⅱ型病毒液 0.25ml ，第三排各试管内，每管加入Ⅲ型病毒液 0.25ml ，加完后摇动试管架充分混匀，置 37 ℃水浴箱 1 小时取出。
 
3) 取 30 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，在每支培养管中加入上述病毒与血液混合液 .0.2ml ，每份混合液接种 2 支细胞培养管。接种后，培养管置于 37 ℃水浴 1 小时取出，于每支培养管内加入 0.8mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
b 实验对照组实验方法
 
1 ）病毒对照组（6号管）
 
取 6 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中加病毒液 0.1ml ，每型病毒液各接种 2 只培养管。然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱 培养。
 
2 ）血清对照组（ 7 号管）
 
取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中加 1:20 稀释的待检血清 0.1ml ，然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
3 ）细胞对照管（ 8 号管）
 
取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
3 结果

在培养第 3 ， 5 ， 7 天各观察一次，观察时将细胞培养管从温箱取出，显微镜低倍视野下观察有无 CPE （细胞病变效应），并按表记录。当细胞出现 CPE 时，可见磁暴生长减缓或停止生长，细胞变大，肿胀，甚至死亡，脱落。观察后，出现 CPE 的培养管可弃去，未出现 CPE 的培养管继续送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养至第 7 天。
 
中和实验 CPE 结果记录:

 

结果判定

1 病毒对照组均应出现 CPE 为“＋”
 
2 血清对照组和细胞对照组不应出现 CPE ，为“－”。
 
二） 中和方法实验二——用已知免疫血清鉴定病毒型别
 
1 材料

1 ） 病毒悬液：选用未知型别的脊髓灰质炎病毒 1 ： 10 稀释液 1ml 。
 
2 ）免疫血清：选用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫血清（ 1 ： 5 稀释）各 0.35ml 。
 
3 ）敏感细胞：选用 Hela 细胞培养管 15 支。
 
4 ）其余材料同方法一。
 
2 方法

a 实验组实验方法
 
1 ） 取待鉴定病毒稀释液 0.75ml 分别与三型特异性免疫血清（各 0.25ml ）等量混合，在 37 ℃ 水浴 1 小时取出。
 
2 ）取 6 支 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支培养管中加入混合液 0.2ml ，每份混合液接种 2 支细胞培养管。接种后，培养管置 37 ℃水浴箱中水浴 1 小时取出，于每支培养管内加入 Eagle 维持液 0.8ml ，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
b 实验对照组实验方法
 
1 ）病毒对照组
 
取 2 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中待检病毒悬液 0.1ml ，送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
2 ）血清对照组
 
取 6 只 Hela 细胞培养管，弃去培养液，每支试管中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型免疫血清各 0.1ml ，然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出，于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液，送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱 培养。
 
3 结果 :

4 结果判定

1 ）方法同方法一
 
2 ）鉴定病毒。待鉴定的病毒与哪一型免疫血清的中和试验结果为阳性，即为该型病毒。
 
注意事项

1 必须选用对细胞有较稳定致病力的病毒。
 
2 灭活的血清必冷却后应用。
 
3 本试验必须要有阳性对照，阴性对照和细胞对照