正常视网膜米勒细胞原代培养
实验材料:
1. 材料来源:人眼、兔眼或者猪眼等;
2. 清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.2;
3. 消化液:0.25%胰蛋白酶-100IU/ml透明质酸酶混合消化液;
4. 消毒无菌的手术器械若干;
实验方法:
1. 取材
(1)取自人的供体眼球;
1) 经常规消毒程序消毒后,于锯齿缘后约1mm处环形切开眼球,去除前段及玻璃体;
2) 用无齿小镊子轻轻剥取视网膜组织,并用眼科小剪子剪去视乳头周围的视网膜及血管;
3) 用液稍洗,去除黏附的色素上皮细胞。置于盛有平衡盐溶液的培养皿中;
(2)取自兔的供体眼球:当取出视网膜组织后,在解剖显微镜下用眼科小剪刀剪去髓放线部分及血管;
2. 原代培养;
1) 在处理完毕的视网膜组织中加入胰蛋白酶和透明质酸酶混合消化液,于37℃调间隙消化30min;
2) 用有血清培养液终止消化。经吹打后,将细胞悬液离心(800r/min)5min;
3) 用培养液重新悬浮细胞,并吸走絮状的纤维样物质;
4) 按4×104~6×104个细胞/ml的密度进行接种;
5) 以常规方法培养。24h后取出培养瓶,置换培养液,以去除没有贴壁的其它细胞;
6) 每周换液2次,在细胞分裂增长至基本融合成单层时传代