凋亡相关基因－Bax的表达产物的检测

1、 培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复）

2、 PBS洗，5min X 3次 (小心)

3、 甲醇固定10min

4、 PBS洗，5min X 3次

5、 加入封闭液（1:10） 25µl，37 ℃，30min，吸去上清液，滤纸吸干

6、 加一抗（1:300）25µl，37 ℃，1h

7、 PBS洗，5min X 3次

8、 加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10µl）25µl，37 ℃，1h

9、 PBS洗，5min X 3次

10、 加0.3％ H2O2-PBS（甲醇），37 ℃，30min

11、 PBS洗，5min X 3次

12、 SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10µl，混匀）20-30µl，37 ℃，1h

13、 PBS洗，5min X 3次

14、 DAB显色：DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。

15、 观察结果

注意事项：

1、 一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。

2、 如果染色背景过高，在SABC反应之后，DAB显色之前，用加有0.01－0.02％的TWEEN20的PBS洗涤标本4次，单纯PBS洗2次，然后DAB显色。