当前位置：主页 > 生物医药 > 文章内容

RD-PCR观察长春新碱诱导肿瘤细胞凋亡时基因表达的变化(1)

作者：中华医学网发布时间：2017-10-12 08:49浏览：次

【原理】

限制性显示PCR技术(RestrictionDisplayPCR,RD-PCR)技术的思路是在获得反转录的cDNA之后,进行Sau3AI酶切?Sau3AI识别位点是四个碱基,理论上计算平均每256个碱基有一个识别位点,然后在酶切片段的两端加上通用接头?接头由15bp和21bp长的两条互补寡核苷酸单链逐步退火形成,接头的一端为4个碱基的粘性端GATC,恰好与选用的Sau3AI的酶切位点互补,另一端为2个碱基的粘性端CA,可以减少片段自身间的串联?酶切片段加上接头之后,用与接头序列配套的限制性引物进行扩增?此时设计的限制性引物是在通用引物的GATC端分别加上一个碱基A?T?C?G(以下简称A?T?C?G),可以使扩增产物有序归类?将引物A?T?C?G两两组合,共10组,以接头与cDNA酶切片段的连接物为模板,进行限制性分组PCR反应,各组产物在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳?经EB染色后,在紫外灯下观察,诱导前后的基因差异一目了然?

【试剂与器材】

1.OligdT150.1μmol/L

2.TRIzol试剂

3.M-MLV

4.内切酶Sau3AI?

5.dNTP2.5mmol/L分别取等体积的10mol/L的dATP,dGTP,dTTP,dCTP四种混合即成

6.TaqDNA聚合酶(国产或进口):浓度为5U/μl,50μl反应液中加1U?

7.消毒三蒸水

8.6×载样buffer0.25%二甲苯青FF,0.25%溴酚蓝,30%甘油

9.50×TAE电泳Buffer12.2gTris,2.85ml冰醋酸,10ml0.25mol/LEDTA(pH8.0),加水至50ml?

10.溴化乙锭(EB)溶液10mg/ml(避光保存),每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液,即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml,此试剂为强致癌物,要戴手套操作,避免污染环境?

11.DNAMarker

12.各种国产或进口移液器(10,20,100μl)

13.消毒的0.2mlPCR管,10μl,100μltips

14.离心机

15.PCR仪

16.水平电泳槽和电泳仪

17.紫外分析仪
【操作步骤】

1.诱导后细胞的总RNA的抽提
将细胞以4.0×108/L密度接种于用12孔培养板中,每孔3mL,37℃?5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁,加入长春新碱,使之终浓度分别为0?10?100μg/mL?继续培养过夜?按Trizol试剂盒说明,在预期时间加入1mLTrizol试剂,置室温5min,吸至1.5mL经DEPC水处理过的EP管中,置室温5min,加氯仿0.2mL,振摇50s,置室温5min,分层?4℃,11000×g离心15min?仔细取上层水相,移至另一EP管中,加0.5mL异丙醇,混匀?置室温10min,4℃11000×g离心10min,用DEPC处理的75%乙醇洗涤沉淀(RNA),4℃,7200×g离心5min,弃上清真空干燥后,沉淀溶解于20μL无RNase的水中,样品保存于-20℃备用?RNA样品用紫外分光光度仪测定A260和A280,计算含量?

2.从总RNA中纯化mRNA,参照mRNA纯化试剂盒说明,步骤如下

• 在0.4ml的总RNA溶液中加入50μl4.5MNaCl,55~60℃水浴10分钟?

• 将以上溶液转移至装有50mgOligodT的1.5ml的离心管中,振摇混匀,室温放置30分钟,每隔5分钟振摇一次?将上述混合粘液转移至另一套在1.5ml的EP管的离心柱,并用0.1ml的SolutionC润洗,室温,10000×g离心4分钟?弃洗脱液?

• 在离心柱中加入0.5ml的SolutionC,轻轻吹打,混匀,室温,10000×g离心4分钟?弃滤液?

• 将离心柱放在另一干净的1.5ml的EP管中,加入0.5mlSolutionD,轻轻混匀,室温,10000×g离心4分钟?将洗脱液转移至另一1.5ml的EP管中,再加入0.5mlSolutionD,轻轻吹打,混匀,室温,10000×g离心4分钟?

• 将两次洗脱液混合,测量总体积,加入1/10体积的SolutionB混匀,再加入两倍体积的无水乙醇,-20℃放置至少10分钟?

• 4℃,10000×g离心10分钟,弃上清,空气干燥5分钟?

• 加10μlSolutionD溶解沉淀,取0.5μl进行定量,其余-70℃保存?

3.从mRNA反转录成为cDNA,参照TaKaRa公司cDNA试剂盒说明,步骤如下:

(1)cDNA第一链的合成

在微型离心管中混合以下反应液,总体积为50ul?