MSCs分化为矿化的成骨细胞(细胞培养1)

试剂和材料：
1.完全培养基（CCM）：α-MEM：α-低限量基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经F杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；
2.DM（骨分化培养基）：CCM包含5mmol/L eta;-甘油磷酸，50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸和1nmol/L地塞米松。过滤除菌；
3.A；
4.胰蛋白酶/EDTA；
5.聚丙烯离心管，15ml和50ml；
6.组织培养皿，6孔，孔面积为9.6cm2；
7.ARS：蒸馏水配制1%ARS，用0.5N氢氧化氨调节pH值到4.1，过滤除菌；
8.福尔马林缓冲液，10%；
9.改良的Neubauer血细胞计数器；

实验方法：
1.从单层细胞中收集MSCs；
2.向6孔培养板的每个孔中加入2ml CCM，共有1&time104个细胞（适用于人或大鼠）。最终密度约1&time103个细胞/cm2；
3.将上排3个孔标记为“成骨”，下排3个孔标记为“阴性”；
4.在37℃，5%CO2环境下孵育，每隔两天更换一次培养基，直到细胞达到7.%—80%汇合；
5.达到所需的细胞密度时，从孔中吸出完全样机，向6孔培养板上排的孔中加入2ml BDM，向下排的孔中加入2ml CCM；
6.在37℃，5%CO2环境下孵育，每隔两天更换一次培养基。ARS检测时，于21天对细胞进行染色；
（1）从培养箱中取出分化后的MSC，每孔中的单层细胞用2ml A润洗两次；
（2）每孔中加入2ml福尔马林，室温固定单层细胞10min；
（3）吸出福尔马林，每孔中加入2ml A润洗两次后，再用2ml蒸馏水润洗一次；
（4）加入2ml ARS溶液，室温孵育30min；
（5）过量蒸馏水润洗各孔，直到“阴性”孔中的背景染色最大限度地清除；
7.用显微镜观察标记为“成骨”的单层细胞评价深红色的程度。成骨分化达到令人满意的水平时，单层细胞ARS着色面积超过50%。此时，单层细胞可在4℃水中最多存放7天。或者，ARS可从着色的单层细胞中提取出来，用先前描述的方案进行测定；